Vitrificación automatizada de crio

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2985 (2022) Citar este artículo

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La velocidad y eficiencia de la recopilación de datos y el procesamiento de imágenes en microscopía crioelectrónica han aumentado durante la última década. Sin embargo, las técnicas de preparación criogénica de muestras se han retrasado y se necesitan dispositivos de preparación de muestras más rápidos y reproducibles. Aquí presentamos un dispositivo de vitrificación con manejo de muestras altamente automatizado, que requiere solo una interacción limitada del usuario. Además, el dispositivo permite la inspección de películas finas mediante microscopía óptica, ya que el exceso de líquido se elimina mediante succión mediante tubos, no con papel secante. En combinación con el control del punto de rocío, esto permite la preparación de películas finas de forma controlada y reproducible. La ventaja es que la calidad de la muestra criogénica preparada se caracteriza antes de la adquisición de datos por microscopía electrónica. La practicidad y el rendimiento del dispositivo se ilustran con resultados experimentales obtenidos mediante vitrificación de suspensiones de proteínas, vesículas lipídicas, células bacterianas y humanas, seguidos de imágenes mediante análisis de partículas individuales, tomografía crioelectrónica y microscopía óptica y electrónica criocorrelacionada.

La criofijación en agua vítrea (hielo amorfo) mediante la congelación rápida de muestras biológicas puede ofrecer una preservación estructural casi perfecta de muestras biológicas como suspensiones de proteínas, virus, bacterias y células eucariotas. La criofijación requiere una velocidad de congelación lo suficientemente alta (>100.000 °C/s) para evitar la formación de hielo (cristales). Como resultado, el agua adopta un estado transitorio metaestable, amorfo, similar al vidrio1. Mediante la vitrificación, la estructura de proteínas y células se puede preservar en su entorno hidratado nativo hasta la resolución atómica. Las muestras vitrificadas son compatibles con las condiciones de vacío requeridas para la microscopía crioelectrónica (crio-EM) y también pueden estudiarse con microscopía óptica de criofluorescencia óptica (cryofLM)2. La microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM)3 reúne las ventajas de la EM (alta resolución, contexto estructural) con las ventajas de la amplia gama de técnicas de microscopía óptica disponibles (imágenes en vivo, etiquetado versátil)4,5.

Se demostró que la vitrificación mediante congelación por inmersión utilizando etano líquido o una mezcla de etano/propano como criogénico6 es un enfoque práctico para la preparación criogénica de muestras biológicas de hasta 10 micrones de espesor1,7. Para la crio-EM, las suspensiones de virus y proteínas purificadas se conservan en finas capas de agua que miden varias decenas de nanómetros, a partir de las cuales se pueden determinar reconstrucciones de resolución atómica utilizando SPA8,9. Las estructuras más grandes, como bacterias y células adherentes de hasta unas pocas micras de espesor, también son adecuadas para la vitrificación. Las reconstrucciones tridimensionales con resolución molecular se pueden determinar mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) de muestras de hasta aproximadamente medio micrón de espesor10,11. Minimizar el espesor de la capa líquida es importante ya que el medio que rodea la muestra dispersa los electrones, lo que aumenta el ruido de fondo en las imágenes, lo que reduce la relación señal-ruido en las imágenes y reduce la resolución alcanzable en las reconstrucciones tridimensionales resultantes.

El paso esencial de generar una fina capa de muestra líquida sobre un soporte de muestra de microscopía electrónica para EM (normalmente una capa de carbono perforada soportada por una rejilla de cobre de 3,05 mm de diámetro) es problemático, ya que las finas capas de agua son inherentemente inestables y es necesario tener un control exacto sobre la El espesor de la capa de agua es difícil. Se descubrió que hacer que la película de soporte sea hidrófila mediante descarga luminosa en aire o alquilamina12,13 ayuda a formar una capa líquida delgada sobre la película de soporte y un ambiente saturado de humedad ayuda a estabilizar la capa delgada. La práctica común actual es aplicar varios microlitros de solución de muestra a una película de soporte descargada por luz, seguido de secar el exceso de líquido usando papel de filtro que posteriormente se congela por inmersión14,15.

Sin embargo, este método tiene varios desafíos. En primer lugar, es difícil controlar el espesor de la capa de agua y determinar su distribución sobre la rejilla. Debido a que el espesor de la capa de agua está influenciado por muchos factores, incluidas las propiedades del soporte, la muestra (tipo, concentración, tampón, solutos, etc.) y las condiciones ambientales (temperatura y humedad)16, los parámetros óptimos a menudo se encuentran a través del tiempo. -Consumo de prueba y error que implica ciclos iterativos de congelación y análisis mediante crio-EM. En segundo lugar, se pierden cantidades relativamente grandes de muestra durante el proceso, ya que la mayor parte de la muestra es absorbida por el papel secante, lo que da como resultado que quede menos de un milímetro de muestra en la rejilla17. En tercer lugar, se informa que el uso de papel secante puede tener efectos desventajosos, como agregación y desnaturalización de proteínas18,19. Además, la aplicación manual de muestras, la manipulación de pinzas y la transferencia entre contenedores y diferentes máquinas consumen mucho tiempo y requieren una importante formación y habilidades de usuario. Debido a que las aplicaciones de vanguardia actuales de crio-EM incluyen carga robótica de muestras de múltiples rejillas, registro de datos altamente automatizado20,21 y procesamiento de imágenes sobre la marcha22, la velocidad y la calidad de la preparación de muestras se han convertido en cuellos de botella en el sector. proceso general.

Se han propuesto y desarrollado métodos de preparación de muestras alternativos a la transferencia, que incluyen la aplicación de cantidades mínimas de una muestra mediante pulverización23,24, dispensación por inyección de tinta25,26, escritura microcapilar18 o impresión con pin de contacto27. Estos métodos no necesitan eliminar el exceso de líquido de la red y la valiosa muestra se utiliza de manera eficiente. Además, los sistemas de vitrificación recientemente desarrollados están altamente automatizados y minimizan los pasos relacionados con la manipulación, la repetibilidad y los problemas de velocidad. Algunas desventajas de estos sistemas son que la distribución de la muestra sobre la cuadrícula es espacialmente limitada o que se necesitan cuadrículas especializadas para una buena distribución28. Además, la mayoría de los sistemas son adecuados para la vitrificación de suspensiones, pero no están diseñados específicamente para funcionar con muestras mucho más grandes, como células o bacterias adherentes. Además, ninguno de estos métodos aborda la resolución de ciclos de prueba que consumen mucho tiempo entre la vitrificación y la evaluación de la calidad mediante crio-EM29.

Aquí nos propusimos desarrollar un dispositivo de vitrificación para criomicroscopía que (i) permita determinar la usabilidad de una muestra vitrificada antes de realizar la criomicroscopía, (ii) sea compatible con todo tipo de muestras (proteínas, bacterias y células), (iii ) produce rejillas de forma reproducible con un espesor de muestra de hielo controlable, y (iv) tiene un alto grado de automatización. Presentamos un dispositivo de congelación por inmersión que tiene una amplia automatización del proceso de preparación de muestras, incluido el manejo de la rejilla, la descarga incandescente, el control de líquidos criogénicos y la aplicación de muestras. El dispositivo utiliza la extracción de muestras mediante succión, no con papel de filtro, y permite la inspección visual de la rejilla durante la formación de una película delgada. La observación de patrones de interferencia mediante microscopía óptica, en combinación con el control de la temperatura del punto de rocío de la rejilla, permite un control preciso del espesor de la capa de agua y la determinación del momento óptimo para la vitrificación. El monitoreo óptico de la formación de películas delgadas antes de la inmersión demostró ser un método utilizable y confiable para evaluar la calidad antes del tedioso análisis crio-EM. Los resultados que informamos aquí muestran que el dispositivo se puede utilizar para la vitrificación de proteínas, liposomas, virus, bacterias y células para técnicas de microscopía crioelectrónica CLEM, tomográfica y de partícula única.

El émbolo Linkam es un dispositivo altamente automatizado que prepara muestras en una rejilla de soporte EM para criomicroscopía electrónica de transmisión. Las características clave son que la aplicación de la muestra se realiza mediante inmersión de la rejilla en la solución de muestra, el ajuste del espesor de la película de muestra se realiza recuperando lentamente la rejilla de la solución de muestra seguido de succión. La temperatura del punto de rocío del aire de la rejilla se controla y la formación del espesor de la capa de agua en la rejilla se inspecciona (y registra) en vivo mediante microscopía de luz de transmisión y/o reflexión. El flujo de trabajo de este sistema Linkam difiere de otros flujos de trabajo de inmersión en rejilla en los pasos posteriores de recuperación de la rejilla desde una caja de almacenamiento, descarga luminosa, aplicación de muestra, eliminación de líquido, vitrificación (inmersión de la muestra en una solución criogénica) y carga en una caja de almacenamiento criogénico. se realizan automáticamente (Fig. 1). En otros dispositivos de congelación por inmersión, es decir, el Thermo Fisher Scientific Vitrobot y el Leica EM GP, el paso más importante se sitúa entre la transferencia y la vitrificación (que determina el espesor de la muestra) y está determinado por un parámetro de tiempo preestablecido. En el émbolo Linkam, todos los pasos están automatizados, excepto la selección del espesor de la muestra, lo que permite una sincronización precisa de la vitrificación.

Descripción esquemática del flujo de trabajo de los dispositivos de inmersión convencionales (arriba) donde la descarga luminosa y la aplicación de muestras no están integradas con la extracción automatizada de muestras y la inmersión posterior. En el enfoque de Linkam (abajo), todos los pasos se integran en un flujo de trabajo automatizado. En este enfoque, la aplicación de la muestra no se realiza pipeteando sino sumergiendo la rejilla en solución y la extracción de la muestra no se realiza secando con papel de filtro sino mediante succión con un tubo. El proceso de formación de capas finas se sigue en vivo y sólo el momento de la inmersión se realiza manualmente, exactamente al revés del flujo de trabajo tradicional.

El diseño de la sección criogénica del émbolo Linkam (Fig. 2) está relacionado con el de la etapa criogénica Linkam CMS 19630. El émbolo contiene un (1) recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido (Fig. 2 a izquierda); (2) una región central (cubierta) que contiene el contenedor criogénico, la cámara ambiental y la unidad de descarga luminosa (Fig. 2b, c); (3) una cámara digital y una lente de microscopía óptica de ×10 (respectivamente detrás y delante de los contenedores); (4) pinzas móviles y controladas mecánicamente (sobre las cámaras), todas ellas montadas en (5) un marco de aluminio que contiene las unidades eléctricas y las bombas. El émbolo Linkam y la cámara están conectados a una computadora portátil con software de control (no en la figura).

un diseño de émbolo Linkam con contenedor de nitrógeno líquido (izquierda), control de pinzas (arriba) alrededor de las cámaras centrales (caja blanca). b Cámaras centrales con una cámara criogénica (izquierda), una cámara ambiental (centro) y un descargador de brillo (derecha) y una lente (abajo). c La cámara criogénica se llena con nitrógeno líquido del contenedor de nitrógeno líquido (ver a) y contiene una caja de almacenamiento de rejilla criogénica y un contenedor de etano líquido (todavía de la Película complementaria 1, para mayor claridad, no se muestran el tubo de gas etano ni la cubierta de latón). La cámara ambiental central contiene dos posiciones para contenedores de muestras y un lugar para tres rejillas. En el centro hay un 'bloqueo de pinzas' con temperatura controlada que enfría las pinzas mientras coloca la rejilla en posición para la eliminación del agua mediante tubos de succión (no mostrados) y la inspección visual simultánea mediante la lente. d Cuadro de cuadrícula para tres cuadrículas. e Bloque de temperatura controlada con recipientes para muestras y cierre para pinzas y hendidura para posicionamiento de rejilla para tubos de succión y microscopía óptica.

El Dewar de nitrógeno líquido (Fig. 2a) contiene hasta 200 ml de nitrógeno líquido que se puede llenar a través de un embudo y proteger con una tapa con un tubo aislante abierto para la salida del gas nitrógeno (no presente en la Fig. 2). El nitrógeno líquido dentro del Dewar se controla mediante un sensor de temperatura y el nivel en la cámara criogénica se mantiene constante con una válvula que controla el llenado.

La cámara criogénica (Fig. 2b, c) contiene una ubicación para colocar una caja de almacenamiento de rejilla criogénica hecha a medida, que puede contener tres rejillas vitrificadas para transporte y almacenamiento y el contenedor de etano líquido. El baño de etano y los tubos de llenado de gas asociados (no mostrados) tienen temperatura controlada para permitir la condensación automatizada del gas etano. Se mantienen un nivel y una temperatura constantes (a -183 °C) para el baño de criógeno líquido para evitar la congelación del etano. Dado que la cámara criogénica es relativamente pequeña, la parte superior de la cámara criogénica está protegida por una placa de cobre enfriada (Fig. 2b) para mantener la temperatura criogénica de la fase gaseosa.

La cámara ambiental (Fig. 2b, c) tiene temperatura controlada mediante un elemento Peltier y se puede ajustar entre 3 y 50 °C. El fondo de la cámara puede contener unos pocos ml de agua desmineralizada para generar humedad por evaporación. El área de la rejilla contiene una caja de rejilla extraíble (Fig. 2c, d) que puede almacenar hasta tres rejillas EM que se pueden recoger y utilizar para la descarga luminosa y la posterior aplicación de la muestra. Alternativamente, contiene una caja con células cultivadas de forma adherente en rejillas EM en líquido. La cámara ambiental también contiene dos posiciones para contenedores de aplicación de muestras líquidas. Una configuración de microscopio integrado con lentes ×10 con modos de luz transmitida y reflejada por LED puede obtener imágenes de la rejilla EM dentro de la cámara de humedad mientras la pinza que sostiene la rejilla se inserta en el "bloqueo de pinzas" frente a la lente. Este 'bloqueo de pinzas' de latón con temperatura controlada (Fig. 2e) contiene una ranura a través de la cual se pueden colocar las pinzas con la rejilla en un cilindro hueco. Aquí la rejilla se coloca para la extracción simultánea de muestras mediante succión y microscopía óptica. Contra el borde exterior de la rejilla se coloca un módulo de succión intercambiable con hasta tres tubos de succión para eliminar el exceso de líquido. La temperatura del "bloqueo de las pinzas" se establece a una temperatura más baja que la de la cámara, de modo que la punta de las pinzas y la rejilla se puedan configurar alrededor del punto de rocío para controlar la evaporación del agua y, por lo tanto, el espesor de la capa de agua y, simultáneamente, evitar un cambio en la concentración de la muestra. .

La unidad de descarga incandescente tiene tres posiciones para las rejillas que se encuentran entre dos electrodos. El volumen se bombea automáticamente a 1,8 × 10-1 mbar en un minuto utilizando una pequeña bomba de vacío sin aceite. La descarga incandescente se realiza automáticamente según ajustes programables, normalmente en 2 minutos a 5 mA en aire.

La preparación del émbolo Linkam para su uso se realiza encendiendo todas las unidades eléctricas (enfriador de agua Peltier, calentador de lentes, émbolo y PC de soporte), conectando o llenando todos los consumibles (cilindro de gas etano, nitrógeno líquido en el Dewar, agua en el medio ambiente). cámara, caja de almacenamiento de rejilla en el contenedor criogénico, rejillas EM en el cartucho de recogida de rejilla, muestra líquida en el contenedor de muestra) e iniciar el software de control del émbolo y la cámara e iniciar el protocolo de llenado de etano líquido. Un protocolo detallado se presenta en la Nota complementaria 1.

La preparación de la crio-rejilla se realiza automáticamente después de iniciar la secuencia programada (Película complementaria 1). Primero, las pinzas recogen una rejilla y la transfieren a la unidad de descarga luminosa, donde se libera y se vuelve hidrófila en plasma de aire. A continuación, la rejilla descargada incandescente se recoge nuevamente y se transfiere al recipiente lleno de muestra donde la muestra se aplica a la rejilla sumergiéndola en el líquido de muestra con temperatura controlada. Se necesita un mínimo de 10 µL para llenar el recipiente de muestra. Al sumergir, en realidad se aplica <0,5 µL sobre la rejilla, que es <2–3 µL que generalmente se usa mediante aplicación manual. Tanto el tiempo de remojo de la rejilla como la velocidad de retracción de la rejilla del recipiente de líquido son programables. Posteriormente, las pinzas colocan la rejilla delante de una lente de microscopía óptica de temperatura controlada × 10. La punta de la pinza y la rejilla que contiene están controladas por temperatura en esta configuración porque la pinza toca el "bloqueo de pinza" de latón con temperatura controlada, fijado unos pocos grados por debajo del punto de rocío de la temperatura de la cámara ambiental. Luego, se coloca un módulo de succión que contiene dos o tres tubos frente a la rejilla, tocando el borde de la rejilla, y al activarse se succiona el exceso de líquido con un flujo ajustable y calibrado. Simultáneamente, el microscopio con la cámara adjunta monitorea visualmente el espesor de la capa de agua en la rejilla y el operador activa el momento de la transferencia al contenedor de etano líquido y la vitrificación por inmersión en función de la imagen de la cámara en tiempo real. Después de la vitrificación, la rejilla se transfiere a la caja de almacenamiento de rejilla criogénica o a un casete criogénico para obtener imágenes de criofluorescencia en la crioetapa CMS196V3.

Para proporcionar una vista de la rejilla para la observación con microscopía óptica en tiempo real, se utilizaron tubos para eliminar el exceso de líquido de la rejilla EM en lugar de papel de filtro (Figs. 3 y 4, Película complementaria 3). La observación microscópica óptica del "líquido a granel" en la rejilla después de la aplicación de la muestra por inmersión no da como resultado ninguna característica específica que conduzca a una estimación del espesor de la capa de agua (Fig. 3a). Cuando el agua se diluye, comienzan a surgir patrones de interferencia de películas delgadas coloreadas, generados por la interferencia de la luz que emana de la interfaz aire-agua en el lado del carbono de la rejilla y la película de carbono (Fig. 3b). Tras una mayor eliminación de fluido, estas franjas de interferencia coloreadas desaparecen, cuando la distancia entre la superficie del agua y la capa de carbono es inferior a ~ 200 nm (Fig. 3c). Después de una mayor eliminación de líquido, aparece un patrón de luz en forma de cruz cuando se forma el depósito de menisco en el costado de la rejilla (Fig. 3d). En ese momento aparece un disco brillante en el centro del cuadrado (Fig. 3e) porque el espesor de la capa de agua en el centro se reduce a aproximadamente menos de una micra (como se observa en la transparencia electrónica resultante después de la vitrificación). A los lados, todavía hay un menisco de agua más grueso adherido a las barras de la rejilla, que aparece en un borde oscuro (Fig. 3f). Tras una mayor eliminación de agua, esta agua también podría eliminarse por completo (no se muestra aquí), pero según nuestra experiencia, también se seca el centro de la rejilla. Las observaciones crio-EM mostraron que solo los dos últimos 'estados' tienen, después de la vitrificación, una capa de agua vitrificada transparente a los electrones (Fig. 3e y f), mientras que los otros estados exceden la profundidad de penetración de los electrones, lo que resulta en cuadrados negros en el crio. -Imágenes EM. Entonces, el momento óptimo para la vitrificación es cuando los cuadrados de la cuadrícula, cuando se observan mediante microscopía óptica, parecen tener una región central brillante y un anillo exterior oscuro. Para obtener un gran campo de visión en nuestros experimentos utilizamos principalmente un objetivo de ×10. Sin embargo, el uso de una lente ×20 permitió observar más claramente las diferencias entre los agujeros abiertos y cubiertos de agua (utilizando lámina de carbono Quantifoil 2/2), lo que permitió determinar con mayor precisión el punto de vitrificación, a expensas del conocimiento sobre el espesor. variación de la capa de agua sobre la rejilla (Figura complementaria 3C).

Evaluación del espesor de la película mediante LM y crio-EM en tiempo real. Primeras dos columnas: observaciones LM (resumen de la cuadrícula, cuadrícula cuadrada), tercera columna: vista crio-EM del mismo cuadrado después de la vitrificación, última columna: vista lateral esquemática, figura explicativa de un cuadrado con barras de cuadrícula en marrón claro, capa de carbono en gris y superficies líquidas en líneas azules. a Justo después de la aplicación de la muestra mediante inmersión, la solución de muestra a granel está presente en ambos lados de la rejilla y no se pueden observar características específicas mediante microscopía óptica. La descripción esquemática muestra la superficie del líquido (líneas azules), las barras de la rejilla (beige) y la capa de carbono en un lado de la rejilla (gris). b Después de eliminar el agua, aparecen anillos de interferencia coloreados, probablemente debido a la interferencia de la luz entre la superficie del agua y la capa de carbono en el lado del carbono de la rejilla. Las líneas de interferencia pueden aparecer dentro de un cuadrado pero también pueden abarcar varios cuadrados. c Los patrones de interferencia desaparecen y cerca de los bordes de la cuadrícula la apariencia cambia ligeramente debido al contacto de la capa de agua con las barras de la cuadrícula. d En el centro de los cuadrados de la cuadrícula aparece un punto más claro, presumiblemente porque la superficie del agua adopta una forma cóncava dentro del cuadrado. e Nuevamente, están surgiendo anillos de interferencia, ahora debido a la interferencia entre la otra capa de agua y la capa de carbono (ver Película complementaria 3). El punto más claro representa capas de agua que son más delgadas que unos pocos cientos de nanómetros: imágenes crio-EM, este cuadrado muestra regiones centrales transparentes a los electrones. Las regiones más oscuras en los bordes de la imagen LM probablemente sean el resultado de la refracción de los rayos de luz y su absorción por las barras de la cuadrícula. f La región central se expande en la imagen LM. Cryo-EM muestra una expansión de la región transparente a los electrones mientras aparece un borde suave en los bordes. Vistas como en e y f son el momento adecuado para la vitrificación y dan como resultado cuadrados de cuadrícula utilizables para imágenes crio-EM. Un criterio visual bueno y simple es que el marco negro alrededor del cuadrado de la cuadrícula retroceda nuevamente después de superar el área más grande como se muestra en (e).

a descripción general LM de la rejilla EM con muestra líquida (arriba, último fotograma de la película antes de la vitrificación) yb descripción general crio-EM de la rejilla después de la vitrificación (arriba). Los números 1, 2 y 3 en a y b denotan los mismos cuadrados de cuadrícula que muestran la apariencia en LM y EM de diferentes espesores de muestra. El espesor óptimo de la muestra se logra alrededor de la posición 2. Tenga en cuenta que en b, recuadro 3, la mayoría de los orificios en la película de soporte no están cubiertos por una capa de hielo, y b, recuadro 2, contiene más orificios utilizables en la película de soporte para la adquisición de datos. Los círculos blancos indican las posiciones de los tubos de succión.

Los experimentos iniciales demostraron que la succión de líquido mediante un único tubo de succión colocado en la parte inferior de la rejilla daba como resultado un gradiente de espesor pronunciado entre los cuadrados llenos de agua y los cuadrados secos. Como consecuencia, en cualquier momento durante el proceso, sólo un número muy limitado de cuadrados mostraba el espesor deseado adecuado para la recopilación de datos. Para obtener más cuadrados con un espesor óptimo y una mejor distribución sobre la rejilla, probamos varias disposiciones de tubos de succión. Parecía que colocar dos tubos de succión en los lados izquierdo y derecho de la rejilla daba los mejores y más reproducibles resultados (Figura complementaria 2). La apariencia, la calidad y la usabilidad general para la recopilación de datos de las rejillas producidas (Fig. 4) fueron comparables a las vitrificadas en nuestro laboratorio utilizando Thermo Fisher Scientific Vitrobot o Leica EM GP.

Dado que la eliminación del agua se realiza desde los lados de la rejilla, mientras que en la posición (central) de la punta de las pinzas el agua a menudo queda retenida en la rejilla, se crea un gradiente de espesor, que permite el momento adecuado de la vitrificación para producir una gran área de rejilla utilizable. cuadrícula. Hay que decir que la propia muestra (composición, viscosidad, tensión superficial) influye en cómo se comporta este gradiente y en cuánta agua se retiene en la rejilla. Además, el tipo de rejillas (malla, vendedor, espesor) y la calidad (arrugas, desgarros, agujeros) de la capa de carbono, así como el tipo de película de carbono (encaje o quantifoil: cantidad y tamaño de agujeros), influye en el comportamiento del agua en la superficie. rejilla durante el adelgazamiento de la capa por succión. Sin embargo, las diferencias individuales entre las rejillas y las muestras no influyeron en la calidad de las rejillas vitrificadas. Durante la preparación, cada muestra se evalúa individualmente.

Además, la observación LM permitió observar varios fenómenos que resultaron útiles para evaluar la calidad de la red. En primer lugar, se pudo observar la agregación de proteínas y vesículas en la rejilla durante la eliminación del agua mediante succión. Los agregados en el rango de tamaño de micras conducen a variaciones locales del espesor de la superficie del agua que se traducen en variaciones de contraste que pueden observarse mediante LM. En la configuración actual no se pudo observar la agregación de proteínas dentro de los agujeros de la lámina. Además, ocasionalmente se observaron parches hidrofóbicos en la lámina de carbono debido a la retracción no uniforme de los bordes del agua (Figura complementaria 3).

Aunque la inspección visual de los cuadrados de la rejilla en la imagen óptica antes de sumergirse es una indicación útil de la calidad y usabilidad de la rejilla vitrificada resultante mediante crio-EM, el espesor de la película de hielo sobre los agujeros en la capa de carbono es de importancia clave. Los orificios individuales de dos micrómetros de diámetro en las rejillas Quantifoil R2/2 EM se pueden observar con una lente ×10 NA 0,25 en combinación con una cámara digital de 5 MP, lo que permite investigar si los orificios permanecen cubiertos de agua o se abren por la gran superficie. tensión. La tendencia general fue que en los cuadrados con agua en sus bordes, los agujeros de la película de carbono se tapan. Cuando hay poca agua en los bordes exteriores del cuadrado, los agujeros están abiertos, no cubiertos de agua.

Si bien la presencia de agua a granel se controla mediante succión, las capas delgadas de agua inherentemente inestables son sensibles a la humedad relativa de su entorno. Dado que el instrumento no tiene control de humedad activo (para aumentar la humedad ambiental y reducir la evaporación), la rejilla está rodeada de una humedad variable de alrededor del 79 % (típica en los Países Bajos). Por lo tanto, la punta de las pinzas y, por tanto, la rejilla se enfriaron unos pocos grados por debajo de la temperatura establecida en la cámara ambiental utilizando un "bloqueo de pinzas" (Fig. 2c) para mantener la rejilla en el punto de rocío y evitar la evaporación18. De esta manera pudimos controlar la evaporación del agua de la rejilla y mantener estados favorables para la vitrificación (Fig. 3e yf) durante varios minutos (Fig. 4 complementaria y Película complementaria 2).

Para validar el rendimiento del dispositivo de vitrificación, probamos una variedad de muestras y técnicas. Aparte de adaptar las concentraciones de la solución, no optimizamos ningún parámetro y todas las muestras se realizaron en unas pocas sesiones de vitrificación. Para el análisis crio-EM de una sola partícula, vitrificamos la apoferritina recién purificada y preparamos algunas rejillas. De una de las cuadrículas registramos varios miles de imágenes y determinamos una reconstrucción de 2,4 Å en la que pudimos encajar la estructura de rayos X (entrada PDB 6RJH) (Fig. 5a).

a Resultados del análisis de partículas individuales para apoferritina (n = 1). Imagen crio-EM típica de la recopilación de datos (izquierda), reconstrucción 3D de apoferritina con una resolución de 2,4 Å (centro) y ajuste de la estructura de rayos X de la apoferritina del bazo de caballo (PDB 6rjh en amarillo) en la densidad EM (derecha). b Cryo-ET en cubos de origami de ADN (n = 1). Vista crio-EM de varios agujeros en una lámina de carbono con agujeros (izquierda) y de la distribución de partículas dentro de un agujero (centro izquierda), un corte del volumen de la tomografía que muestra la parte superior de las cintas de ADN (centro derecha) y una superficie en 3D. Representación de 12 cubos de origami de ADN (derecha, coloreados individualmente). c Cryo-EM de vesículas lipídicas (n = 5). Descripción general de Cryo-EM que muestra el espesor del hielo en una cuadrícula de malla EM que normalmente se usa para la recopilación de datos (izquierda) y una descripción general de la distribución de vesículas dentro de un orificio en la película de carbono (centro izquierda), una sección a través de un volumen de tomograma de una vesícula de varias capas (centro derecha) y la representación de la superficie en 3D de las capas lipídicas individuales (derecha, con capas lipídicas coloreadas).

Para Cryo-ET, vitrificamos cubos de origami de ADN. Esta es una muestra que tiende a agregarse y adherirse a la interfaz aire-agua. Aunque la agregación no se redujo significativamente, pudimos realizar crio-ET. La reconstrucción tomográfica mostró claramente el ADN como las cintas del cubo (Fig. 5b). En otro experimento, destinado a obtener imágenes crio-EM 2D de vesículas liposomales, se vitrificaron vesículas de anfotericina B (Ambisome®). Las imágenes crio-EM de estas muestras mostraron buenas distribuciones de agujeros cubiertos dentro de una cuadrícula y se obtuvieron buenas imágenes de muchos agujeros (Fig. 5c, dos paneles de la izquierda). También se prepararon muestras crio-ET en vesículas multilamelares, revelando múltiples capas de membrana de las vesículas (Fig. 5c, dos paneles de la derecha).

Además de ser adecuado para suspensiones proteicas y liposomales, el dispositivo de vitrificación también permite la preparación de células. Esto se demuestra mediante la vitrificación y la crio-ET de suspensiones de bacterias de E. coli y 17 células de ratón clon 1 que se cultivaron de manera adherente en rejillas EM de oro (Fig. 6a, b). Finalmente, también realizamos crio-CLEM en estas células eucariotas, teñidas fluorescentemente con Mitotracker, mediante imágenes crio-LM posteriores (Fig. 6c, izquierda) y crio-EM adicional (Fig. 6c, centro, derecha).

a Microscopía crioelectrónica de bacterias. Descripción general típica de crio-EM de un cuadrado de malla única de una muestra bacteriana que muestra el espesor del hielo y la distribución de las bacterias (izquierda) y una vista dentro de un orificio en una película de carbono (derecha). b Descripción típica de crio-EM de un solo cuadrado de malla de células cultivadas en una rejilla EM (izquierda) e imagen crio-EM en una parte delgada de la célula que muestra vesículas internas y mitocondrias con inclusiones típicas ricas en fosfato y densas en electrones (derecha). . c Crio-CLEM de células. Descripción general de la imagen de microscopía de luz criogénica de la parte central de una cuadrícula del buscador que es una superposición de una imagen de campo oscuro (blanca) y una imagen de fluorescencia (verde) de células marcadas con fluorescencia (izquierda), superposición de la imagen de fluorescencia crioLM sobre la crio -Resumen de EM (blanco) (centro), el rectángulo rojo indica la posición del cuadrado de malla que se muestra con mayor aumento (derecha).

Teníamos dos incentivos principales para desarrollar y construir este dispositivo de vitrificación para la preparación de muestras crio-EM. Un primer objetivo era hacer que el proceso de vitrificación fuera más consistente, menos dependiente del usuario y más fácil de controlar. Por lo tanto, los pasos de manejo de la rejilla se automatizaron, desde recoger una rejilla EM (de la caja de rejilla personalizada; Fig. 1d) hasta colocar una rejilla crio-EM completamente procesada en un contenedor criogénico para su almacenamiento (y para imágenes crioLM en casetes especializados). )30. Al integrar también la descarga luminosa y la aplicación de muestras, se minimiza la interacción del usuario con la rejilla, teniendo la ventaja de que se minimiza la degradación (arrugas) o la pérdida de la rejilla. Para aumentar la comodidad de uso, la licuación del gas criogénico (etano o etano/propano) y el mantenimiento de los niveles de líquido criogénico (etano y nitrógeno) están completamente automatizados.

Un segundo objetivo era preparar rejillas crio-EM con un espesor más reproducible de la capa de agua vítrea y obtener información directa sobre el espesor de la muestra y la distribución en la rejilla durante la preparación. Tener un conocimiento previo sobre el espesor de la capa de agua vítrea y la usabilidad general de la muestra criogénica preparada, antes de realizar la obtención de imágenes por microscopía crioelectrónica, evita ciclos de preparación de muestras y control de calidad de la rejilla que requieren mucho tiempo en la microscopía crioelectrónica. Para acceder a la información del espesor de la capa durante la eliminación del agua, nos abstuvimos de utilizar papel de filtro, que oscurece la vista en la rejilla, y en su lugar decidimos utilizar la aspiración para eliminar el exceso de líquido, haciendo uso de varios tubos que están colocados en el borde exterior de la rejilla de microscopía electrónica. Mediante succión se pueden regular fácilmente tanto la velocidad como la duración de la eliminación del líquido, a diferencia del papel de filtro convencional, ya que la velocidad de eliminación es una propiedad intrínseca del papel. Nuestro método tiene la ventaja adicional de que elimina cualquier influencia potencial del papel de filtro sobre la química de la muestra18,31. Una gran ventaja de la configuración actual que utiliza aspiración de líquido es que permitió colocar una lente de microscopía óptica con cámara e iluminación para los modos de reflexión y transmisión alrededor de la rejilla y observar la rejilla durante la extracción de la muestra. Los experimentos iniciales que utilizaron una lente × 20 proporcionaron un campo de visión relativamente grande en aproximadamente 45 cuadrados (5 × 9 cuadrados, 423 × 762 µm) con una vista utilizable de los orificios de 2 micrones. La configuración actual y preferida utiliza una lente ×10 (16 × 26 cuadrados; 1,35 mm × 2,2 mm con una cámara mejorada de 20 MP) que proporciona una vista menos detallada de los orificios individuales de 2 micrones, pero ofrece una vista relativamente grande correspondiente a aproximadamente 70% del área total de la red que se puede observar en EM.

La comparación de la microscopía óptica registrada durante la preparación y la microscopía crioelectrónica resultante de las rejillas vitrificadas demostró que el espesor del agua vitrificada en crio-EM se podía estimar cualitativamente mediante microscopía óptica. A partir de imágenes de microscopía óptica, las áreas que son transparentes a los electrones en crio-EM podrían identificarse fácilmente e incluso se podría observar la diferencia entre los agujeros vacíos y llenos de agua en el carbono. Aunque el tiempo entre la última observación LM y la vitrificación es de hasta un segundo, es lo suficientemente rápido como para que no aparezcan muchos cambios. El espesor resultante de las capas de agua vitrificada no se midió cuantitativamente, pero basándose en el tamaño de las partículas de las diferentes muestras y los datos tomográficos, estimamos que las capas de agua vitrificada resultantes varían entre aproximadamente 50 y 200 nm. En conjunto, la observación con microscopía óptica de la interferencia de películas delgadas proporciona una buena estimación de un momento adecuado de vitrificación y da como resultado rejillas con un espesor de capa de agua vitrificada que son prácticamente utilizables.

Aunque la interferencia de la capa fina de luz blanca puede proporcionar información detallada sobre el espesor de la película32, en la configuración actual con transmisión y luz reflejada, no se puede determinar el color exacto. Además, las películas delgadas por debajo de ~100 nm son incoloras y solo cambian de intensidad, que no pueden relacionarse con un espesor específico ya que están enmascaradas por las diferencias de intensidad del fondo. Sin embargo, el análisis cuantitativo de películas delgadas en el rango de 50 a 200 nm es importante para determinar el espesor óptimo para crio-EM de alta resolución de partículas pequeñas y sería una característica deseable para una configuración de émbolo. Con métodos apropiados de detección y análisis con resolución espectral se podría determinar ópticamente el espesor cuantitativo de la película líquida. En principio, se demostró el análisis de color de interferencia utilizando luz de tres longitudes de onda33 o una combinación de holografía e interferometría34 para la medición de películas delgadas ópticas de campo completo. Aunque medir películas con un espesor inferior a 100 nm probablemente necesitará longitudes de onda más cortas.

El agua a granel se puede eliminar eficazmente del borde de la rejilla mediante succión utilizando dos o tres tubos. Esto dio como resultado un espesor de capa de agua distribuida ligeramente variable sobre la rejilla, con las áreas más gruesas cerca del centro de la rejilla y la punta de las pinzas, y las áreas más delgadas cerca de la periferia de la rejilla. Esta variación del espesor del hielo es deseable y garantiza que en cada cuadrícula esté presente un número mínimo de cuadrados utilizables. La optimización de la velocidad de succión es posible, pero en nuestras manos esto no era necesario.

Dado que la inspección visual proporciona conocimientos previos sobre la calidad y usabilidad de las rejillas para crio-EM, solo las rejillas buenas se transfieren al TEM y se utilizan para la adquisición de datos y tenemos un rendimiento perfecto de rejillas, descartando las rejillas ocasionales que no se comportaron bien. bien durante el adelgazamiento, por ejemplo, debido a que la película de soporte se dobla o se rompe, antes de sumergirlo. Para muestras de proteínas purificadas y liposomales, dentro de una sola cuadrícula, normalmente un tercio de los cuadrados (especialmente alrededor de la posición de los tubos de succión) está demasiado seco e inutilizable para la recopilación de datos, un tercio es utilizable (la gran mayoría de los orificios de las láminas están cubiertos). con agua vítrea) y un tercio tiene aproximadamente el mismo número de agujeros de lámina vacíos y llenos, lo que hace que el número utilizable de cuadrados por cuadrícula varíe entre el 30% y el 60% (n = 16). Para las rejillas con bacterias y células adherentes el rendimiento fue mucho mejor ya que el agua se retiene mejor alrededor de estas estructuras y son menos sensibles al secado.

Si bien es valioso tener un conocimiento previo del espesor de las capas de agua vítrea y de la distribución y cantidad de superficie utilizable en una rejilla antes de realizar crio-EM, este no es el único requisito previo para tener rejillas utilizables de alta calidad y con buen comportamiento para la recopilación de datos. . Además, para la recopilación de datos SPA, la calidad de la muestra en términos de orientación preferencial, agregación, concentración en la superficie de la rejilla y alteración de las proteínas35 son parámetros importantes para optimizar la rejilla, que parecen evadir la detección por microscopía óptica. Parecía que se podía observar una amplia agregación de proteínas o vesículas en la rejilla mediante la configuración actual de microscopía óptica, muy probablemente a través de variaciones en el espesor de la superficie del agua. No estudiamos esto en profundidad, aunque nos gusta señalar que se proponen técnicas LM para la investigación de la agregación de proteínas36,37, y que podría valer la pena explorar el uso de métodos LM espectroscópicos o de fluorescencia adicionales durante la preparación de muestras de películas delgadas.

A diferencia de otros dispositivos de preparación de muestras desarrollados recientemente29, no intentamos minimizar la cantidad de muestra utilizada para la aplicación en la rejilla. En cambio, aquí optamos por desarrollar un dispositivo con amplia aplicabilidad y, por lo tanto, evaluamos su usabilidad para una variedad de muestras diferentes. La apoferritina se utilizó como estándar de flujo de trabajo SPA para evaluar la resolución de la reconstrucción. Usando una sola sesión de vitrificación pudimos preparar 9 cuadrículas de tres muestras, de las cuales usamos una, sin ninguna optimización para el espesor del hielo, para una recopilación de datos durante la noche que condujo a un mapa 3D con una resolución de 2,4 Å. También preparamos muestras de cubos de origami de ADN para crio-ET. Se sabe que este tipo de muestra se agrega y se adhiere fácilmente a las superficies de aire y agua. Nuestros experimentos dieron resultados muy similares en comparación con los experimentos que utilizan otros dispositivos de vitrificación. En la misma sesión también preparamos muestras para crio-EM en varios tipos de liposomas, lo que demostró que estas muestras se pueden preparar fácilmente sin mucho esfuerzo ni optimización. Más importante aún, además de la suspensión de partículas, también se podrían preparar células bacterianas y celulares para imágenes crio-EM y crio-CLEM. Las muestras preparadas y los resultados de crio-EM fueron indistinguibles de las mismas muestras que se prepararon con Leica EM GP y Thermo Fisher Scientific Vitrobot Mark IV, a pesar de las grandes diferencias en el diseño y el nivel de automatización.

Por razones de bioseguridad, es importante evitar la liberación de sustancias nocivas. Además, es importante evitar la contaminación cruzada entre muestras. Nos dimos cuenta de que sin una limpieza adecuada de las puntas de las pinzas o el cambio de los tubos de succión, se puede producir contaminación cruzada de las muestras entre las rejillas que se producen posteriormente. La limpieza y la descontaminación se pueden lograr mediante una combinación de elementos intercambiables, enjuague y medidas de esterilización en autoclave a alta temperatura. Los recipientes de inmersión de muestras, así como los cartuchos de recogida de muestras, son intercambiables y pueden esterilizarse en autoclave o desecharse; todos los tubos de silicona son desechables y pueden intercambiarse fácilmente. La gama de baños de inmersión es flexible y los pasos de enjuague o limpieza de la punta de las pinzas se pueden configurar y automatizar en el software. El conjunto de pinzas, el tubo de succión de acero inoxidable y los módulos mecánicos en las inmediaciones de la muestra durante el proceso de succión se pueden cambiar o retirar fácilmente y esterilizar en autoclave. La cámara de humedad se puede enjuagar con, por ejemplo, alcohol isopropílico, acetona o etanol y el diseño tiene radios grandes para facilitar la limpieza. Aunque no fue parte del prototipo probado en este artículo, agregamos y probamos filtros HEPA y canales de escape calentados a alta temperatura (~200 °C) para inactivar componentes biológicamente activos en versiones más nuevas.

El dispositivo presentado en este documento está altamente automatizado y durante la preparación, la interacción del usuario sólo es necesaria para determinar el momento deseado para la inmersión. Los desarrollos futuros incluyen la detección automática del momento óptimo para la vitrificación. Los resultados experimentales presentados aquí indican que las franjas de interferencia de la película delgada, que aparecen, cambian y desaparecen mientras se reduce el espesor de la capa, proporcionan una indicación directa y clara del espesor de la película resultante después de la vitrificación de la muestra, y son fáciles de juzgar por el usuario. Si bien en la configuración actual la decisión de cuándo sumergirse la toma el usuario, imaginamos que en el futuro esta decisión se implementará a través de un sistema de visión artificial convencional o basado en inteligencia artificial. Además, con la detección y el análisis espectralmente resueltos, el espesor cuantitativo de la película líquida podría determinarse ópticamente, haciendo que el proceso de vitrificación sea completamente independiente del usuario.

La apoferritina de bazo de caballo se adquirió de Sigma (9013-31-4) y se purificó inmediatamente antes de la vitrificación mediante filtración en gel en una columna Superdex 200 Incremento 3,2/300 (Cytiva) en NaCl 150 mM. Tris 25 mM pH 7,5, tampón DTT 2 mM. La fracción pico se recogió y se utilizó para la preparación de muestras a una concentración final de 2,5 µM.

Se prepararon liposomas que contenían dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), colesterol y DNP-cap-PE (44:5:50:1 mol%) como lo describieron previamente en 2019 Lubbers et al. 38. Se disolvieron lípidos (Avanti Polar Lipids, AL, EE. UU.) en cloroformo-metanol (9:1 v/v) y se secaron bajo un flujo de gas nitrógeno durante la noche. Se obtuvo una concentración final de lípidos de 0,8 mg/ml rehidratando la película lipídica en sulforodamina B 20 mM (S1402; Sigma Aldrich, Missouri, EE. UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 a 37 °C durante 30 min. . La mezcla de lípidos rehidratados se sonicó durante 5 minutos a 37 °C para formar liposomas, que se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna NAP-25 preempaquetada (17-0852-01; GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Los liposomas se mezclaron con 5 µg/ml de anticuerpos monoclonales IgG1 DNP39.

La anfotericina B liposomal (Ambisome®) se usó en formulaciones como se describió anteriormente40,41 después de una dilución 10X en agua.

Los cubos de origami de ADN se diseñaron utilizando TALOS42 utilizando los ajustes preestablecidos de cubo estándar con una longitud de borde de 84 nucleótidos. Las soluciones plegables se prepararon en tubos de PCR mezclando ADN ss M13mp18 (20 nM, Bayou Biolabs) con las grapas de ADN ss apropiadas (200 nM de cada grapa, Integrated DNA Technologies; ver Datos complementarios 1) suplementadas con MgCl2 20 mM en un volumen total de 50 µL. Los cubos de origami de ADN se recocieron térmicamente en un ciclador térmico Bio-Rad C1000 Touch™ usando el siguiente protocolo: 80 °C hasta 76 °C a una velocidad de 5 min/°C, 75 °C hasta 30 °C a una velocidad de 13,75 min/0,5 °C, 29 °C hasta 20 °C a una velocidad de 10 min/°C. Se combinaron diez soluciones de plegado de 50 µl y posteriormente se purificaron y concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon® ultra de 0,5 ml (MWCO: 100 kDa).

Se prepararon células de ratón 17Clone1 como se describió anteriormente43 y se marcaron con fluorescencia durante 1 h con MitoTracker™ (M7514, Invitrogen) a una concentración final de 0,5 µM a partir de una solución madre de 1 mM en DMSO. Todas las muestras se prepararon en rejillas de cobre de malla Quantifoil 300 con película de carbono R2/2.

Las rejillas se cargaron en un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV, equipado con un detector de electrones directo Gatan K3 BioQuantum. Se adquirieron películas con 50 fotogramas y una dosis acumulada de 65 e/Å2 en modo de conteo utilizando el software EPU (Thermo Fisher Scientific) con un aumento de ×105.000, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 0,836 Å/píxel con un rango de desenfoque de - 0,6 a −2,5 µm. Se recopilaron un total de 2.348 películas en dos sesiones de microscopía en el Centro Holandés de Nanoscopía Electrónica (NeCEN). Los parámetros detallados de adquisición de datos se resumen en la Fig. 1 complementaria y en la Tabla 1 complementaria.

Se utilizó el software RELION-3.1 beta44,45 para todo el procesamiento de imágenes. Brevemente, las películas recopiladas se sometieron a corrección de deriva inducida por el haz utilizando MotionCor246; la función de transferencia de contraste se estimó mediante CTFFIND-4.1.1847. Se utilizó el selector gaussiano RELION para seleccionar automáticamente 689.633 partículas. Después de dos rondas de clasificación 2D, se descartaron los falsos positivos y las características contaminantes, lo que dio como resultado un conjunto de datos de 91.000 partículas. Se utilizó como referencia para el refinamiento 3D un mapa de apoferritina previamente determinado filtrado a 40 Å. El conjunto final de 91.000 partículas se sometió a refinamiento CTF para correcciones de aberración óptica y de inclinación del haz, así como corrección de desenfoque por partícula y astigmatismo por micrografía seguida de pulido bayesiano45,48. Luego se realizó un segundo refinamiento 3D dando como resultado un mapa de 2,4 Å. Las resoluciones de los mapas se estimaron con el criterio de 0,143 de la curva FSC corregida por aleatorización de fase calculada entre dos medios mapas refinados de forma independiente multiplicados por una máscara de solvente de bordes suaves. Las reconstrucciones finales se afinaron y filtraron localmente en el posprocesamiento RELION. El modelo de rayos X de apoferritina del bazo de caballo (entrada PDB 6RJH49) se ajustó a la densidad EM mediante el uso de la función "ajustar en el mapa" dentro de UCSF Chimera50 versión 1.13.1 después de disminuir el tamaño de píxel del mapa EM de 0,836 a 0,82 Å/píxel. para un mejor ajuste. Los mapas se mostraron utilizando UCSF 1.13 y ChimeraX51.

Las imágenes crio-EM se grabaron en un FEI Tecnai T12 Biotwin con fuente LaB6, funcionando a 120 keV en una cámara CCD FEI Eagle 4k × 4k, utilizando un soporte criogénico de entrada lateral Gatan 626. Para la correlación con la última imagen LM registrada antes de la vitrificación, se registraron a mano imágenes de bajo aumento (<×200), cubriendo toda la cuadrícula. Se realizaron resúmenes de imágenes compuestas de toda la cuadrícula y superposiciones con las imágenes LM en Adobe Photoshop.

Cryo-ET se realizó en un Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV, equipado con un detector de electrones directo Gatan K3 BioQuantum. Las series de inclinación se registraron utilizando el software TOMO 4 (Thermo Fisher Scientific) entre −56° y +56° con un paso de inclinación de 2°, comenzando en 0°, con una dosis total de 100 e/Å2 y 16 cuadros por imagen a una aumento nominal de ×19.500, correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 4,4 Å/píxel con un desenfoque de −7 µm. Las series de inclinación de tomografía crioelectrónica se reconstruyeron utilizando el software IMOD52,53. Los renderizados de superficies se realizaron a mano utilizando el software Amira (Thermo Fisher Scientific).

Cryo-LM se realizó en un Zeiss Axioimager M2 equipado con un Linkam CMS196M. Pilas de imágenes fluorescentes y de luz transparente (21 cortes cada 75 µm) que grabamos usando una lente objetivo EC PlanNeofluor × 10 / 0.30 Ph1 en una AxioCam MR R3 con un tamaño de píxel en el nivel de muestra de 1 µm × 1 µm. Las imágenes de campo claro se registraron usando una fuente de luz LED y las imágenes fluorescentes se grabaron usando una fuente de luz HXP de 120 V usando un juego de filtros 38 HE. Las proyecciones de intensidad máxima para ambas pilas de imágenes se realizaron utilizando el software Zeiss ZEN 3.4 y las superposiciones se realizaron en Adobe Photoshop 2021. Cryo-CLEM se realizó en un Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) operado a 200 keV, equipado con un electrón directo Gatan K3 BioQuantum. detector. Se realizaron correlaciones y las imágenes se registraron utilizando el software MAPS (Thermo Fisher Scientific).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

El mapa crio-EM de apoferritina generado en este estudio se ha depositado en EMDB con el código de acceso EMD-13738. Las visualizaciones de video se crearon con Adobe Premiere Pro, Maxon Cinema 4D y Maxon Redshift y están disponibles como Películas complementarias 1 y 2. Los datos que respaldan este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

Dubochet, J. y col. Microscopía crioelectrónica de muestras vitrificadas. Q. Rev. Biophys. 21, 100 (1988).

Artículo de Google Scholar

Phillips, MA y cols. CryoSIM: microscopía de fluorescencia criogénica con iluminación estructurada 3D de súper resolución para imágenes ultraestructurales correlacionadas. Óptica 7, 802–812 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howes, SC, Koning, RI y Koster, AJ Microscopía correlativa para microbiología estructural. actual. Opinión. Microbiol. 43, 132-138 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tuijtel, MW, Koster, AJ, Jakobs, S., Faas, FGA y Sharp, TH Microscopía óptica y electrónica de superresolución criorelativa en células de mamíferos que utilizan proteínas fluorescentes. Ciencia. Rep. 9, 1369 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Chang, YW y cols. Microscopía de localización fotoactivada criogénica correlacionada y tomografía crioelectrónica. Nat. Métodos 11, 737–739 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tivol, WF, Briegel, A. y Jensen, GJ Un criógeno mejorado para congelación por inmersión. Microscopía. Microanal. 14, 375–379 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. y McDowall, AW Microscopía crioelectrónica de virus. Naturaleza 308, 32–36 (1984).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yip, KM, Fischer, N., Paknia, E., Chari, A. y Stark, H. Determinación de la estructura de proteínas de resolución atómica mediante crio-EM. Naturaleza 587, 157-161 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kato, T. y col. CryoTEM con una pistola de emisión de campo frío que lleva la biología estructural a una nueva etapa. Microscopía. Microanal. 25, 998–999 (2019).

Artículo de Google Scholar

Zhang, X. y col. Visualización de vecindades de vesículas de insulina en células beta mediante tomografía crioelectrónica. Ciencia. Adv. 6, eabc8258 (2020).

Bauerlein, FJB y Baumeister, W. Hacia la proteómica visual de alta resolución. J. Mol. Biol. 433, 167187 (2021).

Reissig, M. & Orrel, SA Técnica para la microscopía electrónica de suspensiones de partículas libres de proteínas mediante el método de tinción negativa. J. Ultrastucto. Res. 32, 11 (1970).

Artículo de Google Scholar

Dubochet, J., Groom, M. y Mueller-Neuteboom, S. El montaje de macromoléculas para microscopía electrónica con especial referencia a los fenómenos superficiales y el tratamiento de películas de soporte mediante descarga luminosa. En Avances en Microscopía Óptica y Electrónica. (Eds Barrer, R. & Cosslett, VE) 107–135 (Academic Press, Nueva York, Londres, 1982).

Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J. y McDowall, AW Microscopía crioelectrónica de muestras biológicas vitrificadas. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 10, 138-176 (1985).

Artículo de Google Scholar

Dubochet, J., Lepault, J., Freeman, R., Berriman, JA & Homo, JC Microscopía electrónica de agua congelada y soluciones acuosas. J. Microsc. 128, 219–237 (1982).

Artículo de Google Scholar

Passmore, LA y Russo, CJ Preparación de muestras para crio-EM de alta resolución. Métodos Enzimol. 579, 51–86 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubinstein, JL y cols. Shake-it-off: un sencillo dispositivo ultrasónico de preparación de muestras crio-EM. Acta Crystallogr. Secta. D 75, 1063-1070 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Arnold, SA y cols. Preparación de rejilla de microscopía crioelectrónica sin transferencias y sin pérdidas a partir de muestras de proteínas del tamaño de nanolitros y extractos unicelulares. J. Estructura. Biol. 197, 220–226 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Glaeser, RM ¿Qué tan bueno puede llegar a ser el crio-EM? Nat. Métodos 13, 28–32 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Carragher, B. y col. Leginon: un sistema automatizado para la adquisición de imágenes de muestras de hielo vítreo. J. Estructura. Biol. 132, 33–45 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cheng, A. y col. Leginon: nuevas funciones y aplicaciones. Ciencia de las proteínas. 30, 136-150 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Stabrin, M. y col. TranSPHIRE: procesamiento sobre la marcha automatizado y optimizado con retroalimentación para crio-EM. Nat. Comunitario. 11, 5716 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ashtiani, D. y col. Entrega de gotitas de femtolitro mediante atomización basada en ondas acústicas superficiales para la preparación de rejilla crio-EM. J. Estructura. Biol. 203, 94-101 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Feng, X. y col. Un método de pulverización-inmersión de microfluidos rápido y eficaz para crio-EM de una sola partícula de alta resolución. Estructura 25, 663–670.e663 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dandey, vicepresidente y cols. Spotiton: nuevas funciones y aplicaciones. J. Estructura. Biol. Rev. 202, 161–169 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B. & Potter, CS Spotiton: un prototipo de un sistema integrado de vitrificación y dispensación de inyección de tinta para crio-TEM. J. Estructura. Biol. 179, 68–75 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ravelli, RBG y cols. Estructuras crio-EM de volúmenes sub-nl mediante impresión con pines y vitrificación por chorro. Nat. Comunitario. 11, 2563 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, H. y col. Optimización de las redes de nanocables “autoadhesivas”. J. Estructura. Biol. 202, 170-174 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weissenberger, G., Henderikx, RJM y Peters, PJ Comprensión de las manos invisibles de la preparación de muestras para crio-EM. Nat. Métodos 18, 463–471 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Koning, RI y cols. Microscopía óptica de criofluorescencia correlativa y tomografía crioelectrónica de Streptomyces. Métodos Cell Biol. 124, 217–239 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Glaeser, RM y cols. Factores que influyen en la formación y estabilidad de muestras crio-EM delgadas. Biofísica. J. 110, 749–755 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Afanasyev, YD, Andrews, GT y Deacon, CG Medición del espesor de las pompas de jabón con combinación de colores. Soy. J. Física. 79, 1079–1082 (2011).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Kitagawa, K. Medición del perfil de espesor de película delgada mediante análisis de color de interferencia de tres longitudes de onda. Aplica. Optar. 52, 1998-2007 (2013).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Ferraro, V., Wang, Z., Miccio, L. & Maffettone, PL Análisis cuantitativo y de campo completo de una fina película líquida a nanoescala mediante la combinación de holografía digital e interferometría de luz blanca. J. Física. Química. C 125, 1075–1086 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Carragher, B. y col. Resultados actuales al optimizar la preparación de muestras "estándar" para crio-EM de una sola partícula. J. Microsc. 276, 39–45 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barthélemy, D., Robert, G. & Tudor, A. Detección y caracterización de agregados de proteínas mediante microscopía de fluorescencia. En t. J. Farmacéutica. 329, 37–45 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Sicheng, T., Wenting, W. y Xin, Z. Visualización directa y elaboración de perfiles del plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas en células vivas. actual. Opinión. Química. Biol. 64, 116-123 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Lubbers, R. y col. La carbamilación reduce la capacidad de la IgG de hexamerización y activación del complemento. Clínico. Exp. Inmunol. 200, 1-11 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ugurlar, D. et al. Las estructuras de C1-IgG1 proporcionan información sobre cómo el reconocimiento de patrones de peligro activa el complemento. Ciencia 359, 794–797 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Adler-Moore, J. & Proffitt, RT AmBisome: formulación liposomal, estructura, mecanismo de acción y experiencia preclínica. J. Antimicrobios. Chemadre. 49, 21-30 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Adler-moore, JP & Proffitt, RT Desarrollo, caracterización, eficacia y modo de acción de ambisome, una formulación liposomal unilaminar de anfotericina BJ Liposome Res. 3, 429–450 (1993).

Artículo CAS Google Scholar

Jun, H. y col. Diseño de secuencia automatizado de origami de ADN de estructura alámbrica poliédrica 3D con bordes de panal. ACS Nano 13, 2083-2093 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Wolff, G. y col. Tenga cuidado con la brecha: las juntas de microexpansión disminuyen drásticamente la flexión de las crioláminas fresadas con FIB. J. Estructura. Biol. 208, 107389 (2019).

Artículo PubMed Google Scholar

Scheres, SH RELION: implementación de un enfoque bayesiano para la determinación de la estructura crio-EM. J. Estructura. Biol. 180, 519–530 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Un enfoque bayesiano para la corrección del movimiento inducido por haz en el análisis crio-EM de una sola partícula. IUCrJ 6, 5-17 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ y cols. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por el haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Estimación de aberraciones de alto orden y aumento anisotrópico a partir de conjuntos de datos crio-EM en RELION-3.1. IUCrJ 7, 253–267 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Naydenova, K., Peet, MJ y Russo, CJ Soportes de grafeno multifuncionales para criomicroscopía electrónica. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 116, 11718–11724 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF y cols. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Computación. Química. 25, 1605-1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Goddard, TD y cols. UCSF ChimeraX: enfrentando los desafíos modernos en visualización y análisis. Ciencia de las proteínas. 27, 14-25 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kremer, JR, Mastronarde, DN y McIntosh, JR Visualización por computadora de datos de imágenes tridimensionales utilizando IMOD. J. Estructura. Biol. 116, 71–76 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mastronarde, DN & Held, SR Alineación automatizada de series de inclinación y reconstrucción tomográfica en IMOD. J. Estructura. Biol. 197, 102-113 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

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Agradecemos a Meindert Lamers, Willem Noteborn, Leoni Abendstein, Georg Wolff (CCB, LUMC) por la preparación de las muestras. Este trabajo se benefició del acceso al Centro Holandés de Nanoscopía Electrónica (NeCEN) de la Universidad de Leiden, un centro Instruct-ERIC. La microscopía electrónica dentro de este trabajo es parte del programa de investigación Hoja de ruta nacional para la infraestructura de investigación a gran escala (NEMI), proyecto número 184.034.014, financiado por el Consejo Holandés de Investigación (NWO).

Microscopía electrónica, biología celular y química, Centro médico de la Universidad de Leiden, PO Box 9600, 2300, RC, Leiden, Países Bajos

Roman I. Koning y Abraham J. Koster

Linkam Scientific Instruments Ltd, Tadworth, Surrey, KT20 5LR, Reino Unido

Hildo Vader, Martijn van Nugteren, Peter A. Grocutt, Arnold CF Kamp y Michael Schwertner

NeCEN, Instituto de Biología de Leiden, Universidad de Leiden, Edificio Gorlaeus, Einsteinweg 55, 2333, CC, Leiden, Países Bajos

Wen Yang y Ludovic LR Renault

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RIK: conceptualización, metodología, validación, investigación, redacción—borrador original, visualización, supervisión. MvN: conceptualización, metodología, validación, investigación. HV: conceptualización, metodología, validación, investigación. PÁGINA: Software. AJK: redacción: revisión y edición, adquisición de financiación. AK: conceptualización, metodología, supervisión, adquisición de financiación. WJ: recopilación de datos SPA. LLRR: análisis de datos. MS: conceptualización, metodología, redacción: revisión y edición, supervisión.

Correspondencia a Roman I. Koning.

A Linkam Scientific Instruments Ltd. se le concedió la patente europea EP3018467 A1 “Preparación de muestras microscópicas” (inventores ACFK, MvN, HV, RIK y MS); PAG es empleado de Linkam Scientific Instruments; ACFK es propietario de Linkam Scientific Instruments Ltd., Reino Unido. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Radostin Danev y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Koning, RI, Vader, H., van Nugteren, M. et al. Vitrificación automatizada de muestras crio-EM con espesor de muestra controlable mediante succión e inspección óptica en tiempo real. Nat Comuna 13, 2985 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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Recibido: 02 de diciembre de 2021

Aceptado: 26 de abril de 2022

Publicado: 27 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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