un genoma

Nature Genetics volumen 55, páginas 54–65 (2023)Cite este artículo

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La identificación de los genes y procesos que median las señales de asociación genética para enfermedades complejas representa un desafío importante. Dado que muchas de las señales genéticas para la diabetes tipo 2 (DT2) ejercen sus efectos a través de la disfunción de las células de los islotes pancreáticos, realizamos una prueba de pérdida de función CRISPR agrupada de todo el genoma en una línea de células beta pancreáticas humanas. Evaluamos la regulación del contenido de insulina como una lectura de la función de las células beta relevante para la enfermedad e identificamos 580 genes que influyen en este fenotipo. La integración con datos genéticos y genómicos proporcionó apoyo experimental para 20 transcripciones candidatas a efectores de diabetes tipo 2, incluido el receptor de autofagia CALCOCO2. La pérdida de CALCOCO2 se asoció con mitocondrias distorsionadas, menos gránulos inmaduros que contienen proinsulina y acumulación de autofagosomas tras la inhibición de la autofagia en etapa tardía. Los portadores de variantes asociadas a DT2 en el locus CALCOCO2 mostraron además una secreción de insulina alterada. Nuestro estudio destaca cómo las pantallas celulares pueden aumentar los esfuerzos multiómicos existentes para respaldar la comprensión mecanicista y proporcionar evidencia de efectos causales en los loci de estudios de asociación de todo el genoma.

Los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) han generado miles de asociaciones sólidas para la diabetes tipo 2 (DT2) y rasgos relacionados, pero la mayoría se asignan a regiones no codificantes con una probable función reguladora1. El mapeo fino incompleto significa que la mayoría de los loci GWAS no están mapeados en una única variante causal, sino en múltiples variantes en un conjunto creíble, cada una de las cuales podría influir potencialmente en la expresión génica en un contexto celular diferente. El paso típico después del mapeo fino implica conectar las variantes supuestamente causales y los elementos reguladores con los genes que regulan, utilizando métodos como la colocalización de loci de rasgos cuantitativos de expresión cis (eQTL), la coaccesibilidad de la cromatina unicelular y los ensayos de proximidad del ADN2,3. ,4,5. Las limitaciones de estos enfoques son su dependencia del tipo de célula y del contexto (los ensayos realizados en tipos o estados de células inapropiados pueden revelar conexiones entre variantes y genes no relacionadas con la patogénesis de la enfermedad) y la pleiotropía molecular (las variantes de interés pueden regular la transcripción de varios genes en cis, oscureciendo la identidad de la transcripción causal). Estos enfoques pueden generar hipótesis sobre los efectores candidatos, pero normalmente no llegan a proporcionar pruebas definitivas.

Los estudios de perturbación pueden proporcionar pruebas más convincentes de causalidad, pero sólo si se utilizan modelos auténticos y fenotipos relevantes para la enfermedad6. La evidencia más sólida surge de las variantes de codificación asociadas a enfermedades que proporcionan una lectura de las consecuencias de las perturbaciones de la función de genes y proteínas en humanos, pero la baja frecuencia de la mayoría de estas variantes limita este enfoque2. Los modelos celulares humanos y las tecnologías basadas en CRISPR proporcionan una alternativa atractiva para generar perfiles de todo el genoma de las consecuencias fenotípicas de la perturbación genética y comprender la biología de las enfermedades6. Un elemento central de esta aspiración es la confianza en la relevancia patológica de un tipo de célula. Para la diabetes tipo 2, la evidencia tanto fisiológica como epigenómica resalta el papel central de los islotes pancreáticos y, en consecuencia, de las células beta productoras de insulina, en la mediación del riesgo de enfermedad3,4,5,6,7. Las diferencias sustanciales entre los islotes o células beta de roedores y humanos abogan por el uso de tejido y líneas celulares humanas8,9,10,11,12,13. Nosotros y otros hemos generado grandes recursos transcriptómicos y epigenómicos en este tejido humano clave, lo que permite la integración de datos genéticos y genómicos en todo el genoma para identificar transcripciones efectoras candidatas en los loci T2D GWAS4,7,14,15. Ahora complementamos estos recursos con una prueba de pérdida de función (LoF) CRISPR de todo el genoma en la línea de células beta pancreáticas humanas bien caracterizada EndoC-βH1 para identificar genes que regulan el contenido de insulina16,17,18. La línea celular inmortalizada EndoC-βH1 muestra una firma multiómica similar a las células beta humanas primarias, aunque con características distintas que resaltan el origen fetal y transformado de la línea celular18,19. Si bien el contenido de insulina es menor en comparación con los islotes primarios, las células EndoC-βH1 demuestran propiedades electrofisiológicas y secretoras similares, lo que las convierte en un modelo fisiológicamente relevante para estudiar la función de las células beta in vitro17,20,21,22.

Esta prueba CRISPR de todo el genoma en una línea de células beta humanas proporciona evidencia celular de 580 genes como reguladores de la función de las células beta, respalda un papel causal probable y relevante para la enfermedad de 20 genes en loci T2D e identifica el receptor de autofagia CALCOCO2 como regulador de Función de las células beta humanas. Demostramos que los portadores de alelos de riesgo de diabetes en CALCOCO2 tienen una secreción de insulina alterada y que la pérdida de CALCOCO2 en las células beta humanas conduce a una homeostasis alterada de los gránulos de insulina mediada por autofagia.

La secreción de insulina estimulada por glucosa es la medida principal de la función de las células beta, pero una lectura fenotípica inadecuada para la detección conjunta de alto rendimiento ya que la insulina secretada no puede vincularse a su fuente celular. Sin embargo, a diferencia de la secreción de insulina, el contenido de insulina intracelular se puede cuantificar mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los cambios en el contenido de insulina también se han asociado con genes de riesgo asociados a la diabetes tipo 2, como en el locus de la monooxigenasa α-amidante de peptidilglicina (PAM), donde los alelos de riesgo de diabetes tipo 2 causan una expresión y/o función reducida y la expresión reducida de PAM se asocia con un contenido reducido de insulina o para TCF7L2, el locus que media el mayor riesgo de diabetes tipo 2 y un regulador maestro de la producción de insulina con un contenido reducido de insulina en portadores del alelo de riesgo23,24,25.

Utilizando una lectura FACS, diseñamos una línea de detección CRISPR LoF combinada en la línea de células beta pancreáticas humanas EndoC-βH1 basada en la introducción de inactivaciones de un solo gen (KO) a través de una biblioteca CRISPR de todo el genoma lentiviral (Fig. 1a). Las células se clasificaron en poblaciones que contenían niveles altos o bajos de insulina intracelular y se identificaron sgRNA integrados de manera estable mediante secuenciación de próxima generación.

a, Tubería para una detección CRISPR LoF de todo el genoma en EndoC-βH1 desde la transducción viral (izquierda) hasta la selección de antibióticos (centro) y una selección final de FACS seguida de secuenciación y análisis de enriquecimiento de sgRNA integrados (derecha). b, c, tinción FACS para insulina intracelular en EndoC-βH1 silenciado con INS (siINS, azul) o sus respectivos controles no dirigidos (siNT, rosa) como gráficos individuales (b) o superposición de histograma (c). d,e, La expresión de ARNm asociada de INS (d) y los niveles correspondientes de insulina intracelular medidos por alphaLISA (e). f,g, tinción FACS utilizando el anticuerpo contra insulina (azul) o el control de isotipo (rosa) en la línea celular de riñón embrionario humano HEK293T como gráficos individuales (f) o superposición de histograma (g). h, Tubería para una detección CRISPR a pequeña escala en EndoC-βH1 dirigida solo a tres genes (NMS, INS y PAM) junto con las células de control EV. Las puertas de clasificación FACS para niveles bajos de insulina (línea discontinua) se determinaron en función de las células de control transducidas en paralelo. El enriquecimiento de sgRNA se evaluó en INSlow en comparación con INShigh. i, j, tinción FACS en EndoC-βH1 que compara la tinción con insulina de las células de control EV (rosa) y las células de la pantalla CRISPR a pequeña escala (azul) como gráficos individuales (i) o superposiciones (j). Los cuadros respectivos indican las puertas de clasificación INSlow e INShigh. k, enriquecimiento de sgRNA para todos los sgRNA individuales en INSlow en comparación con INShigh de muestras de control (gris) y controles positivos (INS y PAM, morado y rosa). El diagrama de caja abarca los valores mínimos y máximos, mientras que la línea central representa la mediana. Todos los datos son media ± sem de dos (i – k) o tres experimentos independientes y se muestran gráficos FACS representativos con su respectiva eficiencia de silenciamiento. Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos muestras (e). Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. NT, no focalizado. log2(FC), log2(cambio doble); EV, vector vacío; SSC-A, área de dispersión lateral.

Para garantizar que la lectura del contenido de insulina basada en FACS en EndoC-βH1 fuera altamente específica y sensible, elegimos un anticuerpo y un protocolo basados ​​en la comparación de varias estrategias complementarias (Datos ampliados, figura 1). La eliminación casi completa del INS basada en ARNip en EndoC-βH1 dio como resultado dos poblaciones con distintas intensidades de fluorescencia promedio, lo que validó la sensibilidad (Fig. 1b-d). El nivel de separación estuvo en concordancia con una cuantificación independiente de alfaLISA del contenido de insulina que demuestra alrededor del 46% de proteína residual (Fig. 1e). La especificidad del anticuerpo se confirmó en la línea celular humana HEK293T que no expresa INS (Fig. 1f, g). Finalmente, el protocolo de detección se validó dirigiéndose a tres genes en una detección a pequeña escala, incluidos los genes de control positivo INS y PAM, conocidos por inducir una reducción en el contenido de insulina tras la eliminación, y NMS, un control negativo no expresado en EndoC-βH1 ( ref.23) (Fig.1h). En comparación con un control de vector vacío (EV) que codifica solo Cas9, las células demostraron una señal INS FACS reducida y un enriquecimiento de ARNsg de INS y PAM dentro de la población INSlow, mientras que los ARNsg dirigidos a NMS no mostraron diferencias (Fig. 1i-k). De acuerdo con su efecto más débil mostrado anteriormente sobre el contenido de insulina, los sgRNA dirigidos a PAM demostraron un enriquecimiento altamente replicable pero menor en comparación con los sgRNA dirigidos a INS, lo que confirma la idoneidad de la línea para la detección de todo el genoma23.

Realizamos dos réplicas independientes de detección de todo el genoma en la línea celular beta humana EndoC-βH1, utilizando la biblioteca CRISPR Toronto KnockOut versión 3.0 (TKOv3) dirigida a 18053 genes humanos que codifican proteínas con cuatro sgRNA por gen26. Por réplica, se transdujeron lentiviralmente un mínimo de 670 millones de células con una baja multiplicidad de infección (MOI) con una cobertura de alrededor de 500 células por sgRNA (Fig. 1a). En comparación con los controles, las células de detección demostraron una distribución más amplia de la señal de insulina en el FACS, particularmente hacia una insulina más baja, lo que indica un contenido de insulina alterado debido a los efectos mediados por CRISPR KO (Fig. 2a, b y Datos ampliados Fig. 2). Se recolectaron dos poblaciones de células, aquellas con bajo (INSlow) y aquellas con alto contenido de insulina (INShigh), seguidas de amplificación y secuenciación de sgRNA (Datos ampliados, Fig. 3). Utilizamos el algoritmo MAGeCK para comparar la abundancia de sgRNA e identificar sgRNA enriquecidos o agotados en células INSlow en relación con células INShigh27. Los sgRNA enriquecidos identifican genes reguladores positivos que conducen a una reducción en el contenido de insulina en el gen KO, y los sgRNA empobrecidos identifican reguladores negativos asociados con un aumento en el contenido de insulina en el gen KO. Para reducir el número de resultados falsos positivos, los genes solo se clasificaron como resultados de detección si los sgRNA demostraron efectos consistentes en todas las réplicas y alcanzaron el umbral (FDR <0,1) para al menos dos de los cuatro sgRNA en ambas réplicas de detección independientes. En total, 580 genes cumplieron con estos estrictos criterios; los consideramos resultados de detección sólidos y reproducibles y los llevamos a cabo para una evaluación adicional (Tabla complementaria 1).

a, b, tinción FACS para insulina intracelular en EndoC-βH1 transducida con la biblioteca de detección CRISPR en comparación con células transducidas con virus EV o células teñidas con anticuerpos coincidentes de isotipo que se muestran como gráficos individuales (a) y superposición de histograma (b). c, Cambios en el recuento de sgRNA de una muestra de detección con contenido de insulina bajo a alto, donde cada color representa el mismo sgRNA en las dos réplicas de detección para INS y NKX2-2 (log2(FC) 1,06 y 1,21, respectivamente). La línea discontinua negra representa el recuento medio de sgRNA para este gen. d, distribución de sgRNA de log2 (FC) para todos los sgRNA (azul) en comparación con los sgRNA de control dirigidos a LacZ, EGFP y luciferasa (gris). La línea negra indica los valores medianos de cada grupo. e, distribución de sgRNA de log2(FC) dentro de cada réplica de detección con sgRNA específicos de interés (cuatro por gen) resaltados en colores individuales por gen, mientras que la distribución general de sgRNA se representa en gris claro. f, genes individuales de interés con sus respectivos sgRNA por réplica, el color varía de no significativo (blanco) a altamente significativo (azul oscuro) según el FDR, lo que representa un enriquecimiento o agotamiento significativo de sgRNA entre INSlow e INShigh. INS (+) y NMS (-) en el panel superior representan genes de control positivo y negativo, respectivamente. Los datos provienen de dos réplicas de cribado CRISPR independientes de todo el genoma, y ​​los valores de FDR de cribado se determinaron utilizando MAGeCK (e, f) o mediante una prueba t de dos muestras (d). log2(FC), log2(cambio doble); EV, vector vacío.

Para evaluar la relevancia biológica de estos resultados, preguntamos si nuestra pantalla podía identificar genes que se sabe están involucrados en la regulación de la insulina y la función de las células beta. Los sgRNA dirigidos a INS se enriquecieron en la población INSlow, lo que confirma la sensibilidad de la pantalla (Fig. 2c, e, f). El enriquecimiento general de INS fue menor que el de otros reguladores conocidos de la secreción de insulina, ya que solo tres de cuatro sgRNA indujeron un efecto (Fig. 2c, f). Entre los resultados de detección se identificaron otros reguladores establecidos de la función de las células beta y genes implicados en la diabetes monogénica o el riesgo de diabetes tipo 2, como NKX2.2, SLC2A2, PPP1R15B e IGF2 (Fig. 2c,e,f)28,29,30,31. ,32,33,34,35. Los sgRNA de control no dirigidos no mostraron ningún efecto sobre el contenido de insulina (Fig. 2d). Además de los reguladores directos del contenido de insulina, la prueba también identificó múltiples reguladores generales de transcripción y traducción con efectos indirectos sobre el fenotipo (Fig. 2f), todos ellos clasificados como genes esenciales comunes en las pruebas CRISPR con duraciones de cultivo más largas36,37. 38.

A continuación, consideramos si los resultados de detección estaban enriquecidos con las clasificaciones funcionales involucradas en la regulación del contenido de insulina. El análisis de la vía del término Gene Ontology (GO) y de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) destacó las categorías asociadas a la función de la insulina y las células beta y las categorías relacionadas con la transcripción y la traducción consistentes con la modificación de los niveles de proteína intracelular total (Fig. 3a) 39,40 . El análisis de la red de proteínas STRING enfatizó aún más el papel fundamental del INS dentro de la pantalla como un nodo central con varias conexiones independientes (Fig. 3b) 41. Los aciertos de detección se enriquecieron significativamente para las redes de proteínas compartidas, lo que proporciona confianza adicional en la sensibilidad para identificar complejos interrelacionados (Fig. 3c y Datos ampliados, Fig. 4). Muchos resultados se asignaron a las categorías funcionales de proteólisis y autofagia mediada por ubiquitina, síntesis de ATP mitocondrial, tráfico de vesículas y exocitosis, señalización de GPCR, metabolismo de lípidos y la vía de señalización de MAPK, todos ellos conteniendo reguladores del contenido de insulina previamente desconocidos y aquellos con conocidos. funciones en la secreción de insulina o la función de las células beta.

a, Análisis de enriquecimiento de vías que evalúa las vías KEGG o términos GO para procesos biológicos. Se muestran las vías seleccionadas, clasificadas por valor de P. b, c, análisis de la ruta STRING que muestra asociaciones proteína-proteína, incluidas interacciones físicas y funcionales entre INS y otros resultados de detección (b) y para resultados de detección agrupados en grupos funcionalmente asociados (c).

A continuación, intentamos utilizar nuestra pantalla celular como evidencia de perturbación complementaria para respaldar la asignación de genes efectores en los loci T2D. Aplicamos tres enfoques complementarios (https://t2d.hugeamp.org) que se han desarrollado para combinar los resultados de asociación genética para la diabetes tipo 2 con diversas fuentes de datos genéticos y genómicos para generar listas de los genes 'efectores' con mayor probabilidad de mediar las asociaciones genéticas42,43,44,45. Las asignaciones combinadas de genes efectores de los tres métodos generaron una lista de 336 transcripciones efectoras candidatas en loci T2D, sin que ningún candidato fuera identificado por los tres métodos. La intersección de esta lista con el conjunto de resultados de la pantalla arrojó 20 genes (Tabla complementaria 2) para los cuales nuestra pantalla proporcionó evidencia biológica de un papel en un fenotipo relevante para la enfermedad. De estos 20 genes, 5 (25%) genes se asignan como "causales" mediante el método de predicción de genes efectores heurísticos seleccionados, y otros 4 (20%) genes se asignan entre fuerte, moderado y posible.

Para comparar el rendimiento de nuestra pantalla de perturbación con otros enfoques comúnmente aplicados para la priorización de la transcripción efectora, exploramos un estudio eQTL relativamente modesto, aunque el más grande hasta la fecha, de 420 donantes de islotes humanos15. En este estudio, la colocalización entre las señales T2D GWAS y los islotes cis-eQTL fue respaldada por dos métodos en 20 loci, aumentando a 39 cuando se requirió soporte estadístico para la colocalización de solo uno de los enfoques. Si bien ambos enfoques (cribado CRISPR y eQTL) identificaron números similares de genes, ningún gen fue común entre ellos, lo que sugiere que es poco probable que los eQTL de los islotes causen una reducción del contenido de insulina y que fenotipos celulares adicionales (por ejemplo, la secreción de insulina) pueden ser la base de su efecto. Estas observaciones respaldan la inclusión de múltiples enfoques para la priorización óptima de genes efectores y alientan estudios eQTL más amplios para detectar señales adicionales y una expansión de pantallas específicas y/o de todo el genoma para fenotipos celulares adicionales en tipos de células relevantes.

Centramos nuestros estudios de seguimiento en uno de los 20 genes efectores predichos y el cribado acertó con CALCOCO2 ya que no se ha explorado su papel en las células beta humanas (Fig. 4a) 14,46,47,48,49. CALCOCO2 tiene un papel crucial en la autofagia selectiva al vincular el objetivo de degradación a la maquinaria autofágica50,51. Hasta ahora, se ha demostrado que inicia la autofagia para patógenos invasores (xenofagia) y mitocondrias dañadas (mitofagia)50,51,52. CALCOCO2 se asigna a un locus T2D GWAS que generalmente recibe el nombre del gen TTLL6, donde el mapeo fino ha resuelto la señal en una región de ~177 kb que contiene múltiples genes y 118 variantes en el conjunto creíble5. Una señal variante de codificación independiente dentro de CALCOCO2 (rs10278, p.Pro347Ala) sugiere que CALCOCO2 merece mucha atención como transcripción efectora5. La agrupación fisiológica ha revelado que es probable que este locus ejerza su efecto principal sobre el riesgo de enfermedad mediante la modulación de la función de las células beta5. En esta prueba CRISPR, KO de CALCOCO2 resultó en una disminución en el contenido de insulina (Fig. 4b). Ninguno de los otros genes en este locus mostró un efecto sobre el contenido de insulina en la pantalla, lo que respalda aún más a CALCOCO2 como el probable transcrito efector (Datos ampliados, figura 5).

a, Enfoque de priorización de genes que evalúa genes con baja evidencia como transcripciones efectoras de diabetes tipo 2 (como se describe en el enfoque de integración) que también se han identificado como un éxito de detección, destacó CALCOCO2. b, Cambios en el recuento de sgRNA de una muestra con contenido de insulina bajo a alto, donde cada color representa el mismo sgRNA en las dos réplicas de la pantalla. La línea discontinua negra representa la mediana del recuento de sgRNA para este gen (log2(FC): 1,08). c – n, todos los datos provienen de EndoC-βH1 tratado con siCALCOCO2 en comparación con células de control no dirigidas. c, expresión de ARNm de CALCOCO2 (P = 0,0002). d, Nivel de proteína de CALCOCO2 y su control de carga GAPDH. e, Cuantificación de datos de transferencia Western de CALCOCO2, normalizados para células de control GAPDH y siNT (P = 0,0008). f, mediciones del recuento de células. g, contenido de insulina en pg por 20.000 células, medido por alphaLISA (P = 0,0166). h, Nivel de proteína de insulina y su control de carga GAPDH. El anticuerpo también detecta precursores de insulina, pero sólo da una señal débil en comparación con la insulina madura. i, Cuantificación de insulina y datos de transferencia Western normalizados para células de control GAPDH y siNT (P = 0,0015). j, expresión de ARNm de INS. k,m, secreción de insulina normalizada a siNT (k; P = 0,0051, 0,0336, 0,0282 y 0,0152) o al contenido de insulina y siNT (m) en 1 mM, 20 mM, 1 mM + 100 μM de tolbutamida o 20 mM de glucosa + 100 diazóxido µM. l, n, cambio en la secreción de insulina de 1 a 20 mM de glucosa normalizada a siNT (l) o al contenido de insulina y siNT (n). El nivel de proteína se muestra como un porcentaje de siNT, que se resalta como una línea de puntos en 100%. Todos los datos son media ± sem de tres (c,e,i,j,m,n), cuatro (f), seis (k,l) o 12 (g) experimentos independientes. Los datos se analizaron utilizando la prueba t de dos muestras (c), la prueba t de una muestra (e,i,), ANOVA unidireccional (f,g,j,l,n) o bidireccional (k,m) con Prueba de comparación múltiple de Sidak. Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. FC, cambio de pliegue; NT, no focalizado.

Datos fuente

Obtuvimos una confirmación independiente del efecto de la pérdida de CALCOCO2 mediante la eliminación basada en ARNip en EndoC-βH1. El silenciamiento de CALCOCO2 fue altamente eficiente e indujo una reducción media de ARNm y proteínas de 78,1% y 80,0% (Fig. 4c-e y Datos ampliados Fig. 7). La viabilidad celular no se vio afectada (Fig. 4f). El contenido de insulina intracelular se evaluó mediante dos métodos de detección independientes basados ​​en anticuerpos. Destacando la sensibilidad de la pantalla CRISPR, el contenido de insulina se redujo significativamente en las células silenciadas con CALCOCO2 en un 24,0% y un 38,0%, medido por alphaLISA y Western blot, respectivamente (Fig. 4g-i). Este efecto podría rescatarse mediante la sobreexpresión de CALCOCO2 que alberga mutaciones silenciosas para prevenir el silenciamiento del ARNip (Datos ampliados, figura 5). La reducción en el contenido de insulina no se debió a una disminución de la expresión del gen de la insulina (Fig. 4j).

Para confirmar que esta prueba identificó correctamente genes asociados a la diabetes tipo 2 que modulan la función de las células beta, examinamos genes adicionales que se predijo que serían causales de diabetes tipo 2 y que no fueron identificados como resultados de la prueba (datos ampliados, figura 6)43. QSER1 y PLCB3 contienen variantes de codificación consistentes con un papel causal en la diabetes tipo 2 pero con mecanismo de efecto o tejido de acción no resuelto5,53. De acuerdo con nuestros resultados negativos de detección, la eliminación del ARNip de cualquiera de los genes no afectó el contenido de insulina intracelular ni la secreción de insulina. En conjunto, esta prueba CRISPR de todo el genoma pudo identificar una función reguladora de la insulina de CALCOCO2 y al mismo tiempo distinguir otros fenotipos probablemente relacionados con el desarrollo de las células de los islotes (QSER1) o la acción de la insulina (PLCB3).

Si bien hemos demostrado que el contenido de insulina se reduce con la pérdida de CALCOCO2, no se puede concluir que la secreción de insulina alterada estimulada por la glucosa se base en cambios en el contenido de insulina. Por lo tanto, evaluamos de forma independiente los efectos de la eliminación de CALCOCO2 sobre la secreción de insulina. En promedio, la secreción de insulina se redujo significativamente en un 39,3% tras el silenciamiento de CALCOCO2 (Fig. 4k). Sin embargo, el índice de estimulación de la glucosa de bajo a alto se mantuvo sin cambios, lo que indica una respuesta adecuada a los cambios en las concentraciones de glucosa (Fig. 4l). La normalización del contenido de insulina redujo la diferencia entre las células silenciadas con CALCOCO2 y los controles al 30,2%. Aunque el nivel de secreción de insulina no alcanzó el valor inicial tras la normalización, el efecto no fue estadísticamente significativo y destacó la reducción del contenido de insulina como la causa subyacente de la reducción en la secreción total de insulina (Fig. 4m, n).

Ampliamos nuestros estudios para evaluar la función de CALCOCO2 en islotes pancreáticos humanos primarios. Los estudios de inmunofluorescencia en secciones de páncreas humano confirmaron la expresión y localización de proteínas en el citoplasma de las células beta (Fig. 5a y Datos ampliados, Fig. 7). Para determinar si los efectos de la pérdida de CALCOCO2 pueden replicarse más allá de los modelos in vitro y las células beta, realizamos una eliminación de shRNA en islotes humanos primarios. Los islotes se dispersaron, se transdujeron con shRNA dirigido a CALCOCO2 (shCALCOCO2) y se reagregaron en pseudoislotes (Fig. 5b). La transducción exitosa de pseudoislotes se confirmó mediante la evaluación de la coexpresión de la proteína verde fluorescente (GFP) (Fig. 5c). La expresión de CALCOCO2 se redujo en promedio en un 54,0% en comparación con el shRNA de control no dirigido (shNT; Fig. 5d). De acuerdo con los resultados en EndoC-βH1, la insulina intracelular demostró una reducción modesta pero constante del 15,7% (Fig. 5e). Aunque la disminución de la insulina intracelular en los pseudoislotes fue menor que en EndoC-βH1, se redujo en la misma medida tanto en la línea celular como en el tejido humano primario si se normalizó hasta la eficiencia silenciadora lograda, lo que respalda una relación entre los niveles de CALCOCO2 y la función. Los pseudoislotes, sin embargo, no demostraron una secreción de insulina significativamente afectada (Fig. 5f, g). La estimulación con glucosa elevada y el potenciador de secreción IBMX aumentó la secreción de insulina tras la normalización al contenido en shCALCOCO2. Este efecto se perdió tras la normalización del ADN genómico y, por tanto, refleja el impacto de los cambios en el contenido de insulina en la secreción. De manera similar, evaluamos el contenido y la secreción de glucagón para identificar los efectos potenciales de CALCOCO2 en las células alfa (Fig. 5h-j). Si bien shCALCOCO2 mostró cierta tendencia hacia una secreción atenuada de glucagón, ninguna de las condiciones secretoras o el contenido de glucagón cambió significativamente. En conjunto, nuestros hallazgos muestran que CALCOCO2 tiene un papel importante en la regulación del contenido de insulina en las células beta humanas.

a, Tinción de inmunofluorescencia de islotes humanos primarios en secciones de páncreas. Las secciones se tiñeron doblemente para INS (verde) y CALCOCO2 (rojo). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). La barra de escala es de 10 μm. b – j, Todos los datos provienen de pseudoislotes de shCALCOCO2 en comparación con pseudoislotes de control no dirigidos (shNT). b, Transducción y formación de pseudoislotes a partir de islotes humanos primarios. c, pseudoislotes shCALCOCO2 bajo campo brillante (arriba) y pseudoislotes positivos para GFP (abajo). La barra de escala es de 100 μm. d, expresión de ARNm de CALCOCO2. e,h, Contenido intracelular de insulina (e) y glucagón (h). f,g,i,j, secreción de insulina (f,g) o glucagón (i,j) normalizada al contenido (f,i) o al ADN genómico (gDNA) (g,j) en 2.8, 5.6, 16.7 o 16.7 Glucosa mM + IBMX para la secreción de insulina y glucosa 7, 1, 1 mM + ʟ-arginina o KCl para la secreción de glucagón. Todos los datos son medias ± sem de dos donantes independientes y tres tinciones de inmunofluorescencia independientes. ʟ-Arg, ʟ-arginina; FC, cambio de pliegue; NT, no focalizado.

Sin embargo, aún quedaba por explorar el mecanismo subyacente a la regulación del contenido de insulina por parte de CALCOCO2 en las células beta humanas. Para realizar una evaluación imparcial de los cambios en la expresión del ARNm en EndoC-βH1 tratado con siCALCOCO2, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) (Tabla complementaria 5). Sólo se identificó que CALCOCO2 se expresaba de manera significativamente diferencial, lo que sugiere un mecanismo principalmente postranscripcional sobre el contenido de insulina. Aunque por debajo del umbral de significancia, los dos genes siguientes (B4GALT5 y GCNT1) en la lista de los expresados ​​diferencialmente están involucrados en el procesamiento de glicosilación/O-glicano (Datos ampliados, figura 8). La glicosilación participa en la regulación de la autofagia y, junto con el papel establecido de CALCOCO2 como receptor de autofagia, planteamos la hipótesis de que el efecto de CALCOCO2 sobre el contenido de insulina estaba mediado por la autofagia50,51,54,55,56,57.

Se utilizó inmunofluorescencia para establecer la localización celular de CALCOCO2 en EndoC-βH1 y no mostró colocalización con vesículas de insulina (Datos ampliados, Fig. 7). Luego realizamos microscopía electrónica (EM) para evaluar posibles cambios ultraestructurales celulares tras el silenciamiento con CALCOCO2. De acuerdo con el contenido reducido de insulina total en las mediciones agrupadas, la densidad de las vesículas de insulina se redujo significativamente tras el silenciamiento con CALCOCO2 (Fig. 6a, b). La proporción de gránulos de insulina maduros aumentó en comparación con las células de control, lo que indica que una reducción en los gránulos inmaduros y en transición estaba impulsando el efecto sobre el contenido total de insulina (Fig. 6a, c). Esto se confirmó aún más ya que la densidad de los gránulos maduros no se alteró (Fig. 6d). Las mediciones agrupadas corroboraron de forma independiente los datos estructurales de EM, ya que la pre/proinsulina intracelular (denominada proinsulina) se redujo significativamente tras el silenciamiento, un efecto que no se perdió tras la normalización del contenido total de insulina (Fig. 6e, f). Esta reducción de la proinsulina probablemente no estuvo mediada por una maduración alterada de la insulina, ya que la expresión de los genes implicados en el procesamiento de la insulina (PCSK1, CPE y PCSK2) no se modificó, aunque no se evaluó la actividad enzimática (Datos ampliados, figura 8).

a – l, EndoC-βH1 tratado con siCALCOCO2 en comparación con siNT. a, Imágenes representativas con gránulos de insulina inmaduros (puntas de flecha blancas cortas), gránulos maduros (puntas de flecha blancas largas) y estructuras vacuólicas (puntas de flecha blancas y negras). b, Cuantificación de gránulos de insulina por micrómetro cuadrado (P = 0,0137). c, Cuantificación de gránulos de insulina maduros normalizados al número total de gránulos por célula (P <0,0001). d, Cuantificación de gránulos de insulina maduros normalizados a micrómetro cuadrado. e, Proinsulina (ELISA), normalizada a siNT (P = 0,0033). f, Proinsulina normalizada a insulina total (ELISA) y siNT (P = 0,0081). g, Imágenes EM representativas con ampliaciones (arriba a la derecha), mitocondrias (puntas de flecha blancas) y estructuras vacuólicas (puntas de flecha blancas y negras). h, Cuantificación de mitocondrias alteradas, normalizada al número total de mitocondrias (P = <0,0001). i, mediciones de ATP después de la incubación con glucosa baja/alta, con/sin el inductor de mitofagia FCCP. j, Imágenes representativas de estructuras vacuoladas ampliadas en siCALCOCO2, resaltadas en a y g con puntas de flecha en blanco y negro. k, Tinción representativa de LC3 (izquierda) e INS (centro) tratados con bafilomicina A1 (BafA1) o DMSO. l, Mayor aumento de las regiones LC3 indicadas (cuadro blanco). m – p, islotes humanos primarios no diabéticos intactos. m,n, islotes portadores (GC) y de control (CC) para la variante codificante rs10278 (alelo protector G) en el contenido de insulina (m) y la secreción de insulina (n). P = 0,0029. o,p, islotes con genotipo indicado en la variante principal de GWAS rs35895680 (alelo protector C) en el contenido de insulina (o) y la secreción de insulina (p). P = 0,0004. Los recuadros muestran el rango intercuartílico entre el primer y el tercer cuartil, la mediana (línea horizontal) y los bigotes del percentil 10 al 90 (m – p). Todos los datos son medias ± sem de tres (a,g,i–l) o cuatro (e,f) experimentos independientes; 16 (b, d), 13 (c) y 14 (h) células siNT y 27 (c), 40 (b, d, h) células siCALCOCO2 en tres experimentos independientes y al menos 21 donantes (Tabla complementaria 6; m– pag). Los individuos homocigotos para rs10278 (GG) no se analizaron debido al bajo tamaño de la muestra (m,n). La barra de escala es de 1 μm (a,g), 0,25 μm (j), 20 μm (k) y 10 μm (l). Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos muestras (b – d, h), la prueba de comparación múltiple de ANOVA de dos vías Sidak (i, m – p) o la prueba t de una muestra (e, f). Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. NT, no focalizado.

El análisis EM reveló que la estructura mitocondrial se alteró dramáticamente en las células siCALCOCO2 con crestas y forma distorsionadas, lo que es consistente con una mayor separación o fisión mitocondrial antes de la autofagia (Fig. 6g, h)58. Sin embargo, inesperadamente, la producción de ATP mitocondrial no se vio afectada por la estimulación con glucosa (Fig. 6i). La inducción de la despolarización mitocondrial mediada por FCCP para inducir mitofagia redujo la producción de ATP por igual en siCALCOCO2 y en las células de control, lo que indica mitofagia funcional (Fig. 6i). Los niveles de expresión de los mediadores de mitofagia PINK1 y PARKIN (PARK2) no se vieron afectados (Datos ampliados, Fig. 8). En conjunto, no hubo indicios de que la función mitocondrial o la mitofagia inducida externamente se viera afectada por el silenciamiento de CALCOCO2. Además, EndoC-βH1 silenciado con siCALCOCO2 demostró una acumulación de estructuras vacuoladas, muchas de las cuales contienen restos de componentes celulares, lo que destaca alteraciones en los mecanismos basados ​​en la degradación (Fig. 6j).

Luego evaluamos si esta reducción en los gránulos inmaduros y la proinsulina estaba mediada por un efecto de CALCOCO2 sobre la autofagia. La autofagia es muy dinámica y debe bloquearse artificialmente para medir con precisión la amplitud del flujo autofágico59. Incubamos EndoC-βH1 con el inhibidor lisosomal Bafilomicina A1 (BafA1), que previene la fusión autofagosoma-lisosoma y la degradación lisosomal, y evaluamos los puntos positivos para LC3 que son representativos de los autofagosomas. Si bien la formación de estructuras positivas para LC3 aumentó notablemente en ambas condiciones, la acumulación fue más prominente en las células silenciadas con CALCOCO2 (Fig. 6k, l). La colocalización de autofagosomas positivos para LC3 con gránulos que contienen insulina respaldó aún más una reducción de los gránulos de insulina mediada por autofagia tras la pérdida de CALCOCO2 (Fig. 6k). Además, confirmamos que la reducción de los gránulos de insulina y la proinsulina no estuvo mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma, ya que el inhibidor del proteasoma MG132 no restableció el contenido de proinsulina (Datos ampliados, figura 8).

Nuestros resultados indican que CALCOCO2 es un regulador de la homeostasis de los gránulos de insulina y media su efecto observado sobre el contenido total de insulina a través de la reducción basada en autofagia en proinsulina y gránulos inmaduros.

Habiendo identificado a CALCOCO2 como un regulador del contenido de insulina, a continuación investigamos si los portadores de alelos de riesgo de diabetes tipo 2 en el locus CALCOCO2 exhibían fenotipos secretores similares para respaldar a CALCOCO2 como transcrito efector en este locus. Evaluamos el contenido y la secreción de insulina en islotes primarios intactos de donantes de órganos no diabéticos estratificados por sus genotipos en dos señales independientes de asociación de T2D en el locus CALCOCO2 (Tabla complementaria 6). Seleccionamos una variante de codificación causal probable (rs10278) identificada en un estudio de matriz de exoma y la variante principal GWAS del gran conjunto creíble al 99 % (118 variantes) en el locus asociado a la diabetes tipo 2 (rs35895680)5. Se prevé que la variante rs10278 dé como resultado una sustitución de prolina por alanina en el codón 347 en la mayoría de las isoformas, incluida la isoforma principal en los islotes humanos (NM_005831)5. Su efecto alelo G, que se asocia con un riesgo reducido de diabetes tipo 2, demostró una secreción de insulina alterada estimulada por la glucosa, pero no un contenido de insulina alterado en los islotes primarios (Fig. 6m, n). La variante principal de GWAS rs35895680 (el alelo C reduce el riesgo), que se encuentra en un fuerte desequilibrio de vinculación con una variante en el conjunto creíble ubicada en la 3′-UTR de CALCOCO2, no afectó el contenido de insulina. Sin embargo, los islotes de individuos homocigotos para el alelo protector de T2D demostraron una mayor secreción de insulina en condiciones de alto contenido de glucosa en comparación con aquellos con una copia (Fig. 6o, p). En conjunto, demostramos que las variantes de riesgo asociadas con la diabetes tipo 2 asociadas con CALCOCO2 afectan la secreción de insulina en los islotes humanos primarios, aunque las relaciones de la variante con el contenido de insulina y la función de CALCOCO2 aún están por explorar.

Los esfuerzos recientes para identificar transcripciones efectoras en señales de asociación GWAS se han concentrado en la integración de conjuntos de datos transcriptómicos y epigenómicos relevantes para la enfermedad o en estudios mecanicistas detallados en un solo locus4,7,14,15,23,47,60,61,62,63,64 . Los conjuntos de datos de perturbación de todo el genoma en tipos de células relevantes para enfermedades podrían cerrar la brecha entre la transcripción efectora y la biología de la enfermedad y permitir esfuerzos de traducción enfocados. Aquí, presentamos una pantalla CRISPR LoF combinada de todo el genoma para realizar una caracterización integral de los reguladores del contenido de insulina en la línea celular beta humana EndoC-βH1.

Nuestro enfoque de detección CRISPR logró identificar moduladores sólidos del contenido de insulina, como lo demuestra la detección no solo del gen de la insulina en sí, sino también de genes implicados en tipos monogénicos de diabetes o reguladores conocidos de la transcripción y secreción de insulina. Mediante la integración de nuestros resultados de detección con herramientas de priorización, se identificaron 20 genes como transcripciones efectoras que actúan a través de la disfunción de las células beta. Nuestros datos se suman a un número creciente de conjuntos de datos multiómicos de todo el genoma que pueden aprovecharse para conectar el descubrimiento genético y los mecanismos biológicos y servir como modelo para futuros estudios celulares no solo en células beta humanas. Además, nuestros datos imparciales de todo el genoma serán relevantes para otros rasgos/enfermedades en los que la célula beta pancreática desempeña un papel, incluida la diabetes tipo 1.

Inicialmente identificamos el gen CALCOCO2 asociado al riesgo de diabetes tipo 2 como un éxito en la detección CRISPR y un regulador positivo del contenido de insulina. Seleccionamos este gen para estudios adicionales debido a su potencial para ser la base de una señal GWAS de diabetes tipo 2 y a la falta de conocimiento sobre su papel en la biología de las células beta. Nuestros estudios funcionales enfocados confirmaron su efecto sobre el contenido de insulina y mostraron una reducción indirecta mediada por el contenido de insulina en la secreción de insulina. Por lo tanto, proporcionamos datos funcionales que conectan CALCOCO2 con la función de las células beta, un efecto probable sobre la patogénesis de la enfermedad y el tejido de acción, ampliando la evidencia de un posible papel causal en el riesgo de diabetes tipo 2 (Discusión complementaria)5,53,65.

Si bien se ha informado que CALCOCO2 es un receptor esencial en la mitofagia mediada por Parkin y aunque observamos una ultraestructura mitocondrial alterada, su pérdida no resultó en una función mitocondrial deteriorada en EndoC-βH1 ni en una reducción del aclaramiento de las mitocondrias tras la inducción artificial de la mitofagia, lo que apunta hacia una Mecanismo independiente de las mitocondrias en la regulación del contenido de insulina por parte de CALCOCO252,66,67,68. En cambio, nuestros resultados respaldan un efecto sobre el contenido de insulina a través de la degradación de los gránulos de insulina inmaduros que contienen proinsulina. Si bien aún no se han establecido los efectos de la variante codificante de riesgo de diabetes tipo 2 en CALCOCO2 sobre la expresión y la función, la reducción de la secreción de insulina observada podría representar los efectos a largo plazo de la homeostasis alterada de los gránulos de insulina a través de la expresión adaptada de la insulina y la biogénesis de los gránulos para compensar los cambios en los gránulos. degradación, lo que resulta en un conjunto afectado de gránulos maduros y listos para la secreción.

Si bien esta prueba CRISPR de todo el genoma ha identificado genes involucrados en la función de las células beta y proporciona un recurso para futuras integraciones y estudios en profundidad, solo captura un fenotipo celular relevante para la enfermedad en una condición. La pantalla evaluó los cambios en el contenido de insulina en condiciones de glucosa basal y, en consecuencia, no se capturaron los genes que afectan la secreción de insulina sin modular el contenido de insulina o los cambios en el contenido intracelular que solo ocurren con la falta o estimulación de glucosa.

Este es un paso importante para acelerar los esfuerzos en las pruebas de detección de todo el genoma, tanto de pérdida como de ganancia de función en líneas celulares humanas relevantes para la enfermedad de diabetes tipo 2, y representa una prueba de concepto de que las pruebas celulares pueden aumentar los esfuerzos genómicos vinculando variantes con elementos reguladores y transcripciones con cerrar la brecha entre la expresión genética y la biología celular relevante para la enfermedad. En resumen, hemos desarrollado y realizado una pantalla CRISPR agrupada de todo el genoma en un modelo de células beta humanas, proporcionando un conjunto de datos de perturbación completo para asociar genes de interés con una dirección de efecto, tejido de acción y mecanismo funcional. Hemos demostrado con éxito cómo se puede utilizar un conjunto de perturbaciones de todo el genoma como herramienta de priorización para genes causales en los loci GWAS de T2D y destacamos a CALCOCO2 como un modulador de la homeostasis de los gránulos de insulina y la función de las células beta con un probable papel causal en la diabetes tipo 2.

Se aislaron islotes pancreáticos humanos y tejido de páncreas de donantes fallecidos bajo la aprobación ética de la Junta de Ética en Investigación Humana de la Universidad de Alberta (Pro00013094, Pro00001754) y se obtuvieron del Programa de Distribución Integrada de Islotes (IIDP) financiado por el NIDDK (RRID:SCR _014387). y el Instituto Nacional de Investigación de la Diabetes (NDRI; https://ndriresource.org/). Todas las familias de los donantes dieron su consentimiento informado para el uso de tejido pancreático en la investigación y no recibieron compensación económica. HEK293T y EndoC-βH1 se obtuvieron de Sigma (12022001) y EndoCells, ahora conocidos como https://www.humancelldesign.com, respectivamente19.

Las células HEK293T se pasaron de forma rutinaria en DMEM 6429 (Sigma-Aldrich) que contenía suero de ternera fetal (FCS) al 10 %, 100 U ml-1 de penicilina y 100 µg ml-1 de estreptomicina. EndoC-βH1 se pasaron de forma rutinaria como se describe en Métodos complementarios. Todas las células estaban libres de micoplasma (Lonza) y crecieron a 37 °C y 5% de CO2. Si está indicado, las células EndoC-βH1 se trataron con BafA1 10 nM, MG132 1 μM o DMSO durante 7 h (todos Sigma-Aldrich).

Se obtuvieron muestras de islotes y páncreas humanos no identificados para experimentos de inmunotinción y de shRNA funcional de cuatro donantes de órganos no diabéticos adquiridos a través del IIDP y el Alberta Diabetes Institute Islet Core69. Los islotes humanos para estudios de alelos de riesgo de diabetes tipo 2 se obtuvieron de 194 donantes de órganos no diabéticos (hemoglobina A1C (HbA1C) <6) aislados y evaluados en el Alberta Diabetes Institute IsletCore como se describió anteriormente y cultivados en DMEM con 10 % de FCS y 100 U ml-1 de penicilina. /estreptomicina (todos Thermo Fisher Scientific) a 37 °C y 5% de CO2 (refs. 69,70). El tejido pancreático humano se obtuvo a través del NDRI. Los detalles de los donantes utilizados en el estudio se muestran en las tablas complementarias 3 y 6. No hubo diferencias significativas en edad, sexo, IMC o HbA1c entre los grupos. El ADN se extrajo del tejido exocrino pancreático digerido utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) y el genotipado se realizó en una matriz Infinium Omni2.5Exome-8 BeadChip (Illumina).

Se clonaron sgRNA CRISPR individuales en plentiCRISPRv2 (Addgene, 52961) como se describe en Métodos complementarios. Brevemente, se agregaron colas compatibles con BsmBI a oligonucleótidos de sgRNA complementarios y se hibridaron (Tabla complementaria 4). PlentiCRISPRv2 se digirió y se ligó con oligonucleótidos de sgRNA hibridados, seguido de transformación y amplificación en células competentes. La integración correcta del sgRNA se validó mediante la secuenciación de Sanger y se utilizaron plásmidos para producir lentivirus.

La biblioteca combinada de knockout humano de Toronto (TKOv3) que contiene 71.090 sgRNA basados ​​en una columna vertebral lentiCRISPRv2 fue un regalo de Jason Moffat, de la Universidad de Toronto (Addgene, 90294)26. La biblioteca se transformó y amplificó en Endura Competent Cells (Lucigen) como se describe en Métodos complementarios26. La eficiencia de la transformación se determinó mediante dilución en serie para garantizar la representación de sgRNA, y posteriormente se extrajeron los plásmidos utilizando kits Plasmid Mega (Qiagen). Se preparó una biblioteca de secuenciación como se describe a continuación y la representación de la biblioteca se confirmó mediante secuenciación en un NextSeq500 (Illumina) utilizando lecturas de un solo extremo de 75 pb.

Se produjo y tituló lentivirus para sgRNA clonados individualmente y bibliotecas agrupadas como se describe en Métodos complementarios. Brevemente, los plásmidos CRISPR se cotransfectaron en HEK293T con un 60 % de confluencia con los vectores de empaquetado pMD2.G (Addgene, 12259) y psPAX2 (Addgene, 12260) utilizando reactivos de transfección jetPRIME (transfección Polyplus). El sobrenadante viral se recogió a las 48 h y 72 h después de la transfección y se concentró mediante ultracentrifugación. El título viral funcional se determinó en EndoC-βH1 midiendo el porcentaje de supervivencia después de la transducción con diferentes diluciones virales y selección de antibióticos. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de proliferación celular directa CyQUANT (Invitrogen). La cantidad necesaria de lentivirus para lograr una supervivencia del 26%, que es representativa de una MOI de 0,3, se calculó y se utilizó en transducciones de detección posteriores a pequeña escala o en todo el genoma. Las células EndoC-βH1 se transdujeron 48 h después de la siembra durante 6 h y se seleccionaron durante 7 días en 4 μg ml-1 de puromicina con cambios de medio según fuera necesario.

Se realizaron consecutivamente dos exámenes CRISPR independientes de todo el genoma en EndoC-βH1 con transducciones de bibliotecas lentivirales CRISPR independientes, FACS y sgRNA-seq. Cada análisis se realizó con una cobertura de 500 células por sgRNA y una MOI de 0,3. Se transdujeron un total de 670 millones y 744 millones de células en las réplicas uno y dos, respectivamente. Las células se transdujeron como se describe y se incubaron en 4 μg ml-1 de puromicina durante 7 días con cambios de medio según sea necesario, seguido de recolección, tinción y análisis FACS.

Las células EndoC-βH1 se recogieron y se incubaron con tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Far Red (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con BSA al 1% en PBS. Las células se fijaron y permeabilizaron usando el kit BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante 20 minutos a 4 °C y se lavaron usando Perm/Wash Buffer (BD Biosciences). La tinción con anticuerpos primarios se realizó durante la noche a 4 °C seguida de la incubación con anticuerpos secundarios adecuados diluidos en tampón Perm/Wash (Tabla complementaria 4). Tras probar varios anticuerpos dirigidos a INS, se utilizó un anticuerpo monoclonal de conejo anti-INS de Cell Signaling (3014) en el análisis de todo el genoma. Las muestras se filtraron a través de un filtro celular de 70 μm y se clasificaron en un FACSAria III (BD Biosciences) usando una boquilla de 100 μm. Junto con las muestras se analizaron controles de isotipo y transducción teñidos con cada anticuerpo solo. Las muestras se clasificaron en función de células vivas y individuales antes de la evaluación del nivel del INS. Las puertas para las células con nivel reducido de INS (INSlow) se establecieron en función del control de isotipo y el 10% más alto de las células que expresaban INS se clasificaron como INShigh. Las muestras de células clasificadas se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción del ADN. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando Flowjo 10.6 (BD Biosciences).

El ADN se extrajo de muestras congeladas clasificadas por FACS utilizando el kit QIAamp Blood Maxi/Mini (Qiagen) y se procesó para la secuenciación en un enfoque de PCR de dos pasos. Los sgRNA integrados se amplificaron utilizando la polimerasa Q5 (NEB) con una entrada de ADN de 2,5 μg por reacción y un número optimizado de ciclos por muestra. Se conectaron adaptadores Illumina TruSeq específicos a cada muestra utilizando polimerasa Q5 (NEB) con un número optimizado de ciclos (Tabla complementaria 4). Los productos de la PCR se procesaron en un gel al 2 % y se purificaron utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen). Cada muestra de la biblioteca de Illumina se cuantificó mediante qPCR utilizando el kit de cuantificación de la biblioteca KAPA (Roche) antes de agruparla, y se realizó una secuenciación multiplexada en un NEXTSeq500 (Illumina) como lecturas de 75 pb con un cebador de secuenciación estándar de Illumina y PhiX con un aumento de aproximadamente el 20 %.

Los archivos de lectura de secuenciación fastq sin procesar se fusionaron para cada muestra utilizando el comando 'cat'. Para identificar sgRNA enriquecidos y empobrecidos en esta pantalla CRISPR, utilizamos el algoritmo MAGeCK (v0.5.9.2)27. Brevemente, el comando 'count' se usó para extraer y contar secuencias de sgRNA de los archivos fastq sin procesar según la entrada de la biblioteca TKOv3, lo que arrojó un recuento de lecturas promedio de 981 lecturas alineadas por sgRNA (Datos extendidos, Fig. 3). Se excluyeron los sgRNA con recuentos de lectura bajos de menos de 10 y los sgRNA que se asignan a genes que no se expresaron en EndoC-βH1. El comando 'prueba' se utilizó con el módulo emparejado para evaluar y analizar el enriquecimiento o agotamiento de sgRNA entre las poblaciones INSlow e INShigh. La mediana del análisis normaliza los recuentos de lectura entre muestras para tener en cuenta la profundidad variable del recuento de lecturas y aplica un modelo de varianza media para identificar un enriquecimiento o agotamiento significativo de sgRNA. Las puntuaciones de enriquecimiento a nivel de sgRNA ajustadas mediante pruebas múltiples de MAGeCK fueron la base para la selección de aciertos a nivel de gen. Aplicamos criterios estrictos adicionales para priorizar solo los aciertos con efectos altamente consistentes en ambas réplicas que requieren que los genes tengan un FDR <0,1 para al menos dos de los cuatro sgRNA en ambas réplicas independientes. El análisis de pantalla CRISPR se realizó en Python 3.8 y R 3.5.

Las vías enriquecidas de GO y KEGG dentro de los resultados de detección se determinaron utilizando la Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado 6.8 con homo sapiens como lista y entrada de fondo39. Se identificaron redes de conectividad de proteínas basadas en interacciones físicas y funcionales entre los aciertos de detección utilizando STRING v11 (ref. 41). Sólo se seleccionaron interacciones con una puntuación de confianza alta de ≥0,9.

El silenciamiento directo basado en ARNip en EndoC-βH1 se realizó 24 h después del cultivo en placa utilizando ARNip ON-TARGET plus SMARTpool o un control no dirigido (Dharmacon; Tabla complementaria 4) a una concentración final de 15 nM. Los ARNip se preincubaron con Lipofectamine RNAiMAX al 0,4% (Invitrogen) en medio libre de suero reducido Opti-MEM (Gibco) durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de agregarlos gota a gota al cultivo. Las células se analizaron o recogieron 72 h después de la transfección. El silenciamiento con CALCOCO2 en los experimentos presentados en la Fig. 6 se realizó a una concentración final de ARNip de 50 nM y se evaluó después de 96 h.

Se obtuvieron construcciones lentivirales que codifican shRNA dirigidos a CALCOCO2 humano de Dharmacon (Tabla complementaria 4) y el virus se produjo como se describió anteriormente. Los islotes primarios se dispersaron en células individuales mediante digestión enzimática (Accumax, Invitrogen) y se transdujeron 1 x 106 células con 1 x 109 unidades virales por 1 ml. Las células de los islotes transducidas se cultivaron en placas de pocillos de fijación ultrabaja durante 5 días antes de realizar más análisis.

Se introdujeron mutaciones silenciosas en el CDS de CALCOCO2 humano en cuatro sitios objetivo según las regiones objetivo del ARNip de CALCOCO2 ON-TARGET plus SMARTpool. Se agregaron sitios de restricción que contienen motivos EcoRI y BamHI y secuencias de Kozak a los extremos 5' y 3' del CDS. El fragmento del gen se sintetizó (IDT) y se clonó en el plásmido pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP. El plásmido vacío sirvió como control en experimentos posteriores. Se produjo lentivirus como se describió anteriormente y se transdujeron células EndoC-βH1 a una MOI de 0,5.

El ARN para el análisis de la expresión génica de EndoC-βH1 se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se sintetizó en ADN complementario utilizando el sistema de transcriptasa inversa GoScript (Promega). El ARN para el análisis de la expresión génica de pseudoislotes humanos primarios se extrajo utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Life Technologies) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena Maxima (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La qPCR cuantitativa (qPCR) se realizó utilizando ensayos de PCR en tiempo real TaqMan en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (todos Applied Biosystems, tabla complementaria 4). Los valores de Ct se analizaron utilizando el método ΔΔCt y los genes diana se normalizaron al promedio combinado de PPIA, GAPDH y TBP de mantenimiento. La expresión de CALCOCO2 en EndoC-βH1 y los islotes primarios se extrajo de datos de RNA-seq previamente publicados y analizados71,72.

RNA-seq se realizó mediante captura PolyA con un promedio de> 20 millones de lecturas de extremos emparejados en un NEXTSeq500 (Illumina). Los archivos Fastq se alinearon con la referencia del genoma humano (GRCh38) utilizando STAR v2.7.9a (Alineación de transcripciones empalmadas con referencia) con anotaciones del gen ENSEMBL (v101). Los niveles de expresión genética se contaron utilizando featureCounts (v2.0.1) en lecturas exónicas. La expresión diferencial se comparó mediante la prueba de Wald en DESeq2 (v1.26.0). Los valores de P se ajustaron mediante el método de Benjamini y Hochberg.

Las integraciones de sgRNA en la pantalla a pequeña escala se cuantificaron utilizando PCR cuantitativa basada en SYBR Green y un cebador dirigido a las respectivas secuencias de sgRNA (Tabla complementaria 4). El ADN de EndoC-βH1 clasificado por FACS se extrajo como se describe. Cada muestra se preparó utilizando 20 ng de ADN total y SYBR Green PCR Master mix (Bio-Rad), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se amplificaron y analizaron como se describe para los experimentos de expresión génica.

Las células EndoC-βH1 silenciadas se privaron de alimentos durante la noche a las 48 h después de la transfección en un medio de cultivo que contenía glucosa 2,8 M, seguido de una incubación de 30 minutos en glucosa 0 mM. La secreción de insulina se inició mediante incubaciones estáticas en las condiciones indicadas de glucosa o secretagogos durante 1 h. Se recogió el sobrenadante que contenía insulina y las células se lisaron en etanol ácido helado para liberar insulina intracelular. La insulina se cuantificó utilizando el kit de detección AlphaLISA de insulina (humana) y el lector de placas EnSpire Alpha (ambos Perkin Elmer) en base a diluciones 1:10 y 1:200 para el contenido de sobrenadante e insulina, respectivamente. La proinsulina intracelular se cuantificó utilizando el kit Proinsulina ELISA (Mercodia). La insulina secretada se normalizó al nivel de contenido de insulina intracelular o recuento de células, que se midió antes de la lisis celular utilizando el ensayo de proliferación celular directa CyQUANT (Invitrogen).

Se preincubaron grupos de 15 islotes por triplicado durante 1 h a 37 °C en tampón de timbre de Krebs (KRB) (NaCl 115 mM; KCl 5 mM; NaHCO3 24 mM; CaCl2 2,5 mM; MgCl2 1 mM; HEPES 10 mM (pH 7,4); BSA al 0,1%) con glucosa 1 mM. Posteriormente, los islotes se incubaron durante 1 h en KRB de glucosa 1 mM seguido de una estimulación de 1 h en KRB de glucosa 16,7 mM. Se eliminaron los sobrenadantes y se extrajo el contenido total de insulina del sedimento de los islotes usando etanol ácido. Las muestras se almacenaron a -20 °C y se analizó la insulina mediante quimioluminiscencia utilizando el ELISA de insulina humana STELLUX Chemi (Alpco).

Se utilizaron lotes de 25 pseudoislotes por donante para ensayos de secreción in vitro en RPMI 1640 (Gibco) suplementados con diferentes niveles de glucosa. Para los ensayos de secreción de insulina, los pseudoislotes se preincubaron durante 1 hora con glucosa 2,8 mM seguido de una incubación con concentraciones de glucosa 2,8, 5,6, 16,7 y 16,7 mM + IBMX durante 60 minutos cada uno. Para los ensayos de secreción de glucagón, los pseudoislotes se incubaron a concentraciones de arginina-glucosa de 7, 1, 1 mM + 10 mM durante 60 minutos cada uno. Se recogieron los sobrenadantes y las células se lisaron en etanol ácido para extraer el contenido de insulina y glucagón. La insulina humana en los sobrenadantes y los lisados ​​de pseudoislotes se cuantificó utilizando un kit ELISA de insulina humana (Mercodia). El glucagón humano en los sobrenadantes y los lisados ​​de pseudoislotes se cuantificó utilizando un kit ELISA de glucagón humano (Mercodia). Los niveles secretados de insulina y glucagón se presentan como porcentaje del ADNg, cuantificado a partir de los lisados ​​de pseudoislotes.

Se incubaron EndoC-βH1 durante 1 h a 37 °C en tampón de ensayo de secreción de glucosa (SAB) (NaCl 114 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 1,16 mM, NaHCO3 25,5 mM, CaCl2 2,6 mM, HEPES 20 mM (pH 7,3), 0,2% BSA). Después de la inanición, las células se estimularon durante 40 minutos con SAB que contenía glucosa 0 mM o 20 mM suplementado con DMSO o FCCP 10 μM y se lisaron en 100 μl de tampón de ensayo ATP (Biovision). El contenido de ATP en los lisados ​​se midió utilizando un ensayo luminométrico siguiendo las instrucciones del fabricante (Biovision) y se normalizó al contenido de proteínas totales según lo determinado mediante el ensayo de proteínas BCA (Pierce).

Los extractos de proteínas de células enteras se obtuvieron a partir de sedimentos celulares mediante lisis en tampón RIPA (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%) que contenía un cóctel de inhibidor de proteasa 1X (Roche). . Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando el ensayo de proteína DC (Bio-Rad), se mezclaron 10 μg de proteína total con tampón de muestra (4 × tampón Laemmli (Bio-Rad), β-mercaptoetanol al 10 % (Sigma-Aldrich) y se hirvieron durante 10 minutos a 80 ° C. Las muestras desnaturalizadas se procesaron en un gel prefabricado sin manchas Criterion TGX al 4-20% durante 15 minutos a 300 V en tampón Tris-glicina-SDS y se transfirieron a un difluoruro de polivinilideno de 0,2 μm utilizando el Trans-Blot. Sistema de transferencia Turbo (todo Bio-Rad). La unión de anticuerpos no específicos se bloqueó mediante incubación con BSA al 3 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 (TBST) al 0,1 % durante 1 h a temperatura ambiente. Las incubaciones de anticuerpos primarios se realizaron a 4 ° C durante la noche seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente (Tabla complementaria 4). Se tomaron imágenes de las transferencias usando el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad) y se reprobaron como se describe usando anticuerpos de control de carga del tamaño apropiado. Se utilizó el software Lab 6.0 (Bio-Rad) para cuantificar las bandas de proteínas y las proteínas de interés se normalizaron con su respectivo control de carga en la misma transferencia.

Análisis de inmunofluorescencia en tejido pancreático humano. Los páncreas se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche, se crioincrustaron y se prepararon secciones de 4 μm. Las secciones de tejido se sumergieron en agua destilada, se hirvieron durante 20 minutos en una solución de recuperación de objetivos (Dako), se permeabilizaron durante 10 minutos a temperatura ambiente usando PBS-Triton X-100 al 1% (Sigma-Aldrich) y la unión de anticuerpos no específicos se bloqueó usando 1%. BSA (Roche), 0,2% leche desnatada, 0,5% Triton X-100, 1% DMSO en PBS (todo Sigma-Aldrich). Las incubaciones de anticuerpos primarios se realizaron durante la noche a 4 °C seguidas de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor a temperatura ambiente durante 1 h (Tabla complementaria 4). Los portaobjetos se montaron utilizando medios de montaje VectaShield que contenían DAPI (Vector Laboratories) y se tomaron imágenes en un microscopio Zeiss AxioM1 (Zeiss) utilizando un objetivo de ×20 y ×40. Se utilizó el software ImageJ 1.52b para preparar imágenes de inmunofluorescencia.

Se sembraron células EndoC-βH1 en portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek II (Thermo Fisher Scientific) y se fijaron con PFA-K-PIPES al 3% y PFA-Na2BO4 al 3% durante 5 y 10 minutos, respectivamente, seguido de permeabilización con Triton al 0,1%. X-100 durante 30 min a temperatura ambiente (todo Sigma-Aldrich). Las células se incubaron en una solución de bloqueo que contenía suero de burro al 5% (Jackson ImmunoResearch) en PBS durante 30 minutos. Los anticuerpos primarios se diluyeron en una solución de bloqueo y los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor y DAPI (MP Biomedicals) a temperatura ambiente durante 1 h (Tabla complementaria 4). Las imágenes se realizaron en un microscopio confocal STELLARIS 8 (Leica Microsystems).

Las células EndoC-βH1 control y silenciadas se resuspendieron en gelatina al 10% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) a 37 °C y se dejaron equilibrar durante 5 minutos. Las células se sedimentaron, se eliminó el exceso de gelatina, se enfriaron a 4 °C y se incubaron con tetróxido de osmio al 1% frío en rotación durante 2 h a 4 °C. Se lavaron tres veces con agua ultrafiltrada fría y se tiñeron en bloque durante la noche en acetato de uranilo al 1% a 4 °C mientras se rotaban. Las muestras se deshidrataron en una serie de lavados con etanol (30%, 50%, 70% y 95%) durante 20 min cada uno a 4 °C, se equilibraron a temperatura ambiente, se lavaron en etanol al 100% dos veces y se incubaron en óxido de propileno (PO ) durante 15 min. Las muestras se infiltraron con resina EMbed-812 mezclada con PO en proporciones 1:2, 1:1 y 2:1 durante 2 h cada una. Se incubaron en resina 2:1 a PO durante la noche rotando a temperatura ambiente, se colocaron en EMbed-812 durante 4 h y posteriormente en moldes con resina fresca seguido de una incubación a 65 °C durante la noche. Se recogieron secciones de 80 nm en rejillas de Cu de malla 100 recubiertas de formvar/carbono y se tiñeron durante 30 s en acetato de uranilo al 3,5% en acetona al 50%, seguido de citrato de plomo al 0,2% durante 3 minutos. Las imágenes se realizaron con JEM-1400 120 kV (JEOL) y las imágenes se tomaron con una cámara digital Gatan Orius 4k × 4k. La cuantificación de las imágenes fue realizada de forma independiente por tres evaluadores ciegos.

Los análisis estadísticos se realizaron en Prism 8.1 (software GraphPad). Varias réplicas biológicas independientes se muestran como puntos de datos individuales con los números exactos indicados en las leyendas de las figuras respectivas. Las barras de error representan el error estándar de la media. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Se excluyó un valor atípico significativo en las evaluaciones de los islotes primarios de portadores de riesgo de diabetes tipo 2 según la prueba de valor atípico ROUT preestablecida (Q = 1%). Si correspondía, se representaron los cambios en veces, pero el análisis estadístico se realizó en valores transformados logarítmicamente. Si era necesario, como para el análisis de imágenes, los evaluadores estaban cegados a la asignación de la muestra. Las variables distribuidas normalmente se compararon entre dos o más grupos mediante la prueba t de Student para dos muestras o ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. Las muestras que se normalizaron con su control respectivo dentro de una única réplica se analizaron mediante una prueba t de Student para una muestra.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los archivos de secuenciación Fastq de la pantalla CRISPR se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) en EMBL-EBI con el número de acceso PRJEB44712. Los archivos de secuenciación Fastq de experimentos de secuenciación de ARN para muestras de siCALCOCO2 se han depositado en el Archivo Europeo Genoma-Fenómago (EGA) con el número de estudio EGAS00001006127 y se puede acceder a los datos de expresión de EndoC-βh1 de un estudio publicado anteriormente en PRJEB15283 (ENA)71. Los datos están disponibles gratuitamente para descargar, mientras que los recuentos procesados ​​se pueden encontrar en el Conjunto de datos complementario 1. Los datos de RNA-seq se alinearon con la referencia del genoma humano GRCh38 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/fasta/ homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz) y contado con la anotación genética (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.101.gtf .gz) descargado de la base de datos de Ensembl. Se puede acceder en línea a los datos de origen de las transferencias no procesadas y a los datos ampliados. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código fuente de MAGeCK está disponible gratuitamente en http://liulab.dfci.harvard.edu/Mageck y el análisis diferencial de expresión génica se realizó utilizando el paquete DESeq2 R. El código respectivo está disponible en https://doi.org/10.5281/zenodo.7226348.

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ALG es un miembro senior de Wellcome en ciencias biomédicas básicas. AKR y SKT son becarios del Departamento de Medicina de Radcliffe y AKR recibió una beca de viaje de la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (EFSD). ALG fue financiado por Wellcome (200837), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) (U01-DK105535, U01-DK085545, UM1DK126185) y el Centro de Investigación de Diabetes de Stanford (premio NIDDK P30DK116074). El proyecto contó además con el apoyo del Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) (1S10RR026780-01) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (otorga R01 DK108817 y R01 DK107507 a SKK) y una Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil (beca JDRF) (para RJB). PEM cuenta con el apoyo de la Cátedra de Investigación de Canadá en Biología de los Islotes y en parte de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP, 148451). Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del laboratorio Gloyn por sus consejos y aliento, a Dylan Jones por la amplificación de la biblioteca, a Ruddy Montandon por la clasificación FACS, al Oxford Genomics Center (Wellcome Center for Human Genetics) por la secuenciación, a Gene Vector and Virus Core (GVVC) por generar el lentivirus con plásmidos vectoriales CALCOCO2, el núcleo EM en Cell Sciences Imaging Facility (CSIF) para la preparación de muestras EM y el proyecto descrito fue apoyado, en parte, por el premio ARRA 1S10RR026780-01 del Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR). ). Agradecemos a Karla Kirkegaard por sus consejos con la tinción LC3. Agradecemos a Yan Hang, Mollie Friedlander y Islet Core del Stanford Diabetes Research Center por su apoyo con los ensayos de secreción hormonal. Reconocemos con gratitud a los donantes de órganos y sus familias, y la obtención de islotes a través del Islet Core del Instituto de Diabetes de Alberta con la asistencia del programa Human Organ Procurement and Exchange (HOPE), Trillium Gift of Life Network (TGLN) y otras organizaciones canadienses de obtención de órganos, la Programa de Distribución Integrada de Islotes (US NIH UC4 DK098085), el Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades y el Instituto Internacional para el Avance de la Medicina. Todas las familias de los donantes dieron su consentimiento informado para el uso de tejido pancreático en la investigación. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Yingying Ye, Elena Navarro-Guerrero.

Centro de Diabetes, Endocrinología y Metabolismo de Oxford, Departamento de Medicina de Radcliffe, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Antje K. Rottner, Soren K. Thomsen, Sameena Nawaz y Anna L. Gloyn

Departamento de Pediatría, División de Endocrinología, Facultad de Medicina de Stanford, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Yingying Ye, Varsha Rajesh, Alina Pollner, Jing Yang, Han Sun, Daniel Ebner y Anna L. Gloyn

Target Discovery Institute, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Elena Navarro-Guerrero & Roberta Baronio

Departamento de Biología del Desarrollo, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Romina J. Bevacqua y Seung K. Kim

Centro de Investigación de la Diabetes de Stanford, Facultad de Medicina de Stanford, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Romina J. Bevacqua, Seung K. Kim y Anna L. Gloyn

Departamento de Farmacología e Instituto de Diabetes de Alberta, Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá

Aliya F. Spigelman, Austin Baptist, James Lyon, Nancy Smith, Jocelyn E. Manning Fox y Patrick E. MacDonald

Centro de Investigación Biomédica NIHR de Oxford, Oxford University Hospitals Trust, Oxford, Reino Unido

Agatha Wesolowska-Andersen y Anna L. Gloyn

Wellcome Center for Human Genetics, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Anna L. Gloyn

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AKR, YY, SKT y ALG concibieron el estudio. AKR, EN-G. y SKT realizó experimentos de optimización de detección CRISPR. AKR, EN-G., RB y SN realizaron la pantalla CRISPR. ES-G. y RB realizó la preparación de la biblioteca de secuenciación. AKR analizó los datos de detección CRISPR. AW-A. contribuyó al análisis de detección CRISPR. AKR y ALG realizaron análisis de integración de datos. AKR realizó la validación de CALCOCO2, QSER1 y PLCB3 en células beta. AFS, AB, JL, NS, JMF, PEM y ALG evaluaron los alelos de riesgo de CALCOCO2 en islotes humanos. YY, VR, AP y JY realizaron estudios de seguimiento de CALCOCO2 en EndoC-βH1. AKR y RJB realizaron inmunotinciones de islotes. RJB, AKR y VR realizaron experimentos de eliminación de shRNA de islotes. HS analizó los datos de RNA-seq. SKK, JMF, DE, PEM y ALG supervisaron la investigación. AKR y ALG escribieron el manuscrito. Todos los autores aprobaron el borrador final del manuscrito.

Correspondencia con Anna L. Gloyn.

Los autores declaran los siguientes intereses en competencia: AKR es ahora empleado de AstraZeneca, SKT es ahora empleado de Vertex Pharmaceuticals y AW-A. Ahora es empleado de Genomics plc. DE y EN-G ahora también están afiliados a XCellomics. Todo trabajo experimental de AKR, SKT y AW-A. se llevó a cabo bajo empleo en la Universidad de Oxford. AKR posee acciones de Astra Zeneca. El cónyuge de ALG posee opciones sobre acciones de Roche. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Genetics agradece a Bridget Wagner y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Histogramas que muestran diferentes estrategias de tinción FACS en EndoC-βH1 comparando la insulina intracelular (gráfico azul) y los respectivos controles de isotipo (gráfico rosa) usando (a) diferentes anticuerpos monoclonales primarios como se indica (anticuerpo violeta, azul, rosa) en combinación con un Ab secundario ( gris) conjugado con AF488 (verde) o conjugación directa con FITC (verde) y (b) usando diferentes protocolos de tinción con varios tampones de fijación (fila superior) o permeabilización (fila inferior) como se indica. Se realizaron tres experimentos independientes y se muestran histogramas representativos. La detección CRISPR de todo el genoma se realizó utilizando el anticuerpo anti-INS de Cell Signaling y los reactivos y protocolos comerciales de fijación y permeabilización Cytofix/Cytoperm de BD Sciences.

Imágenes FACS representativas y puertas de clasificación para EndoC-βH1 teñido en las pantallas CRISPR de todo el genoma. (a) Clasificación de puertas que evalúan el tamaño, la granularidad y la viabilidad de las células para excluir desechos, definir singletes y células vivas. (b) Recurrir a una población de células con bajo nivel de insulina para evaluar la pureza de la muestra. SSC-A, área de dispersión lateral; FSC-A, área de dispersión hacia adelante; FSC-W, ancho de dispersión hacia adelante.

(a) Esquema de la pantalla CRISPR desde la clasificación FACS inicial de EndoC-βH1 transducido hasta el análisis de secuenciación final. (b, c, e) Lea el recuento y control de calidad de sgRNA mapeado para niveles bajos de insulina (LOW1, LOW2), niveles altos de insulina (HIGH1, HIGH2) y muestras de referencia (REF1, REF2) de ambas réplicas, incluidos: (b) recuentos totales de lectura y la proporción de lecturas mapeadas y (c) el número de sgRNA de recuento cero como proporción del total de sgRNA y (e) distribuciones de recuento de lecturas normalizadas. Los cuadros muestran el IQR entre el primer y el tercer cuartil, la línea horizontal muestra la mediana y los bigotes muestran Q3 + 1,5 × IQR y Q1 − 1,5 × IQR. (d) Análisis de componentes principales en recuentos de lectura de sgRNA normalizados para los dos primeros componentes de contenido de insulina bajo (gris) y alto (azul) y muestras de referencia (púrpura) de ambas réplicas. (f – i) Análisis de correlación de Pearson por pares de los cambios entre el contenido bajo y alto de insulina para cada réplica (f), réplicas de referencia (g), réplicas con bajo contenido de insulina (h) y réplicas con alto contenido de insulina (i). La línea violeta indica la línea de regresión lineal. Log2FC, log2 (cambio de veces); r, coeficiente de correlación de Pearson. Todos los datos son lecturas de sgRNA de dos réplicas independientes de cribado CRISPR de todo el genoma.

Análisis de la ruta STRING que muestra asociaciones proteína-proteína, incluidas interacciones físicas y funcionales para resultados de detección CRISPR. Los conglomerados se identificaron, anotaron y trazaron individualmente manualmente y se muestran los conglomerados seleccionados. El nivel de confianza para determinar las interacciones se estableció en el nivel de confianza más alto (0,9).

( a ) Locus CALCOCO2 con un conjunto creíble de señales de asociación GWAS (arriba) y genes vecinos (abajo). ( b – g ) distribución del recuento de sgRNA para los 8 sgRNA por gen (4 sgRNA por réplica) en la detección CRISPR de todo el genoma para genes en el locus CALCOCO2. Cambios en el recuento de sgRNA de una muestra con contenido de insulina bajo a alto y cada color representa el mismo sgRNA en las dos réplicas de la pantalla. La línea discontinua negra representa el recuento medio de sgRNA para este gen. (h) EndoC-βH1 se transdujeron de manera estable con virus de control y ARNip (NTsi), virus de control y siCALCOCO2 o lentivirus para expresar CALCOCO2 que alberga mutaciones silenciosas (mutCALCOCO2) que lo hacen resistente a siCALCOCO2 (P = 0,0352). Los datos se normalizaron con respecto a su control respectivo (siNT) y se analizaron mediante una prueba t de una muestra. Todos los datos son media ± SEM de seis experimentos independientes o dos réplicas de pantalla CRISPR de todo el genoma independientes. Valor p * < 0,05. Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. NT, no focalizado.

(a) Enfoque de priorización de genes que combina genes con evidencia causal como transcripciones efectoras de diabetes tipo 2 (como se describe en el enfoque de integración) sin ser un éxito de detección, destacaron QSER1 y PLCB3. PLCB3 desempeña un papel en la vía de amplificación en la célula beta, pero también se ha asociado con la acción de la insulina en un enfoque de agrupamiento fisiológico de múltiples rasgos. QSER1 ha sido identificado recientemente como un regulador de la metilación del ADN asociado con defectos de diferenciación pancreática. (b) Cambios en el recuento de sgRNA de una muestra con contenido de insulina bajo a alto, donde cada color representa el mismo sgRNA en las dos réplicas de la pantalla. La línea discontinua negra representa el recuento medio de sgRNA para este gen. (d – n) Todos los datos provienen de EndoC-βH1 tratado con siQSER1 o siPLCB3 en comparación con células de control no dirigidas. (d) expresión de ARNm de QSER1 y PLCB3 en sus respectivas células silenciadas (azul) en comparación con las células de control siNT (gris) (P = 0,0010, 0,0005). (e) Contenido de insulina en pg por 20 000 células. (f) expresión de ARNm de INS. ( g, k ) Secreción de insulina normalizada a siNT o (i, m) al contenido de insulina y siNT en 1 mM, 20 mM, 1 mM + tolbutamida 100 μM o glucosa 20 mM + diazóxido 100 μM. (h, j, l, n) El pliegue de la secreción de insulina cambia de 1 a 20 mM de glucosa. Todos los datos son media ± SEM de tres (d, f – n) o 12 (e) experimentos independientes o dos pantallas CRISPR independientes de todo el genoma (b, c). Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos muestras (d, h, j, l, n) y ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Sidak (e, f, g, i, k, m). Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. Valores de p *** < 0,001. FC, cambio de pliegue; LFC, log2 (cambio veces); NT, no focalizado.

Tinción de inmunofluorescencia de EndoC-βH1 tratado con siCALCOCO2 o siNT (a) y tejido exocrino en secciones de páncreas (b). Las secciones se inmunotiñeron doblemente para INS y CALCOCO2 (rojo o verde como se indica). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). La barra de escala es de 6 μm (a) o 10 μm (b). d: células ductales; a: células acinares; yo: islote. NT, no focalizado. Todas las imágenes son representativas de tres tinciones de inmunofluorescencia independientes.

Todos los datos provienen de EndoC-βH1 tratado con siCALCOCO2 en comparación con células de control no dirigidas. (a – d, g, h, k – m) expresión de ARNm de los genes diana indicados medidos en RNA-Seq (a – d, k – m) o qPCR (g, h) con sus respectivas células silenciadas (azul) en comparación con Células de control siNT (grises) (P = 1,87 × 10-6). ( e, f ) Cuantificación de mitocondrias alteradas en imágenes EM basadas en formas o crestas anormales, normalizadas al número total de mitocondrias por el evaluador ciego dos y tres (P <0,0001, 0,0032). (i, j) Cuantificación de gránulos de insulina maduros normalizados al número total de gránulos por célula en imágenes EM por el evaluador ciego dos y tres (P = 0,0002, 0,0002). (n, o) Nivel de proteína de PCSK1 (n), PCSK2 (o) y su control de carga GAPDH. (p, q) Cuantificación del nivel de proteína de transferencia Western PCSK1 (p) y PCSK2 (q) normalizado a las células de control GAPDH y siNT. r,s) Contenido de insulina (r) o proinsulina después del tratamiento con MG132 a 1 μM (+), 10 μM (++) o DMSO en comparación con las células de control siNT (línea de puntos). Todos los datos son media ± SEM de tres experimentos independientes o al menos dieciséis células medidas por tres evaluadores independientes (e, f, i, j). El nivel de proteína se muestra como porcentaje de siNT, que se resalta con una línea de puntos al 100%. Los datos se analizaron mediante la prueba t de dos muestras (e–j), la prueba de Wald en DESeq2 ajustada mediante el método de Benjamini y Hochberg (a–d, k–m), la prueba t de una muestra (p, q) y una ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Sidak (r, s). Ninguna representación gráfica de importancia indica resultados no significativos. Valores de p ** < 0,01, *** < 0,001, **** < 0,0001. NT, no focalizado.

Datos fuente

Tablas complementarias 2 y 3, Métodos y discusión.

Tabla complementaria 1: visitas a la pantalla. Tabla complementaria 2: Genes causales priorizados para la diabetes tipo 2 según la integración con las predicciones del gen efector de la diabetes tipo 2. Tabla complementaria 3: detalles del donante de tejido humano. Tabla complementaria 4—Recursos. Tabla complementaria 5: ARN-seq. Tabla complementaria 6: donante de islotes. Tabla complementaria 7: aciertos de sgRNA. Tabla complementaria 8: Screen_all sgRNA.

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Reimpresiones y permisos

Rottner, AK, Ye, Y., Navarro-Guerrero, E. et al. Una prueba CRISPR de todo el genoma identifica CALCOCO2 como un regulador de la función de las células beta que influye en el riesgo de diabetes tipo 2. Nat Genet 55, 54–65 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

Descargar cita

Recibido: 21 de mayo de 2021

Aceptado: 26 de octubre de 2022

Publicado: 21 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

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