La esteatosis periportal en ratones afecta distintos parámetros del metabolismo pericentral de los fármacos

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21825 (2022) Citar este artículo

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Se sabe poco sobre el impacto de los trastornos morfológicos en distintas zonas sobre la zonificación metabólica. Recientemente se describió que la fibrosis periportal afectaba la expresión de las proteínas CYP, un conjunto de enzimas metabolizadoras de fármacos ubicadas pericentralmente. Aquí, investigamos si la esteatosis periportal podría tener un efecto similar. Se indujo esteatosis periportal en ratones C57BL6/J alimentándolos con una dieta rica en grasas con bajo contenido de metionina/colina durante dos o cuatro semanas. La gravedad de la esteatosis se cuantificó mediante análisis de imágenes. Los triglicéridos y la actividad CYP se cuantificaron mediante ensayos fotométricos o fluorométricos. La distribución de CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6 y CYP2E1 se visualizó mediante inmunohistoquímica. Los parámetros farmacocinéticos de los fármacos de prueba se determinaron después de inyectar un cóctel de fármacos (cafeína, codeína y midazolam). El modelo dietético dio como resultado una esteatosis mixta de moderada a grave confinada a las áreas periportal y mediazonal. La esteatosis periportal no afectó la distribución zonal de la expresión de CYP, pero la actividad de CYP seleccionadas se asoció con la gravedad de la esteatosis. La eliminación de cafeína se aceleró en la esteatosis microvesicular, mientras que la eliminación de midazolam se retrasó en la esteatosis macrovesicular. En resumen, la esteatosis periportal afectó los parámetros del metabolismo de los fármacos ubicado pericentralmente. Esta observación exige más investigaciones sobre la interrelación altamente compleja entre la esteatosis y el metabolismo de los fármacos y los mecanismos de señalización subyacentes.

Se sabe poco sobre la alteración morfológica en distintas zonas lobulares que afectan la función hepática, como el metabolismo de fármacos dependiente del citocromo p450 (CYP).

Las enzimas citocromo p450 son una superfamilia de proteínas que catalizan la oxidación de sustancias orgánicas, un paso importante en la desintoxicación de fármacos1,2. Las enzimas CYP se encuentran en todos los órganos principales, pero predominantemente en el hígado2. Las enzimas CYP hepáticas normalmente se expresan en la región pericentral del lóbulo hepático3. Esto es importante ya que las diversas vías y funciones metabólicas están sujetas a una organización espacial a lo largo del eje portocentral en el lóbulo hepático, un fenómeno llamado zonación metabólica4,5,6,7.

Parece obvio que la necrosis o daño de la región pericentral afectará la expresión pericentral así como la actividad de las enzimas CYP8. Sin embargo, el impacto del daño periportal o las alteraciones en los procesos pericentrales es bastante difícil de alcanzar. Existe la primera evidencia de que las alteraciones periportales también pueden tener un impacto en los procesos metabólicos pericentrales. Ghallab et al. demostraron recientemente que la fibrosis pericentral y periportal tenía una influencia similar en la expresión zonada de las proteínas CYP hepáticas. En ambos casos, la fibrosis provocó una pérdida de leve a completa de la expresión pericentral de CYP8. Sin embargo, no investigaron la actividad del CYP in vivo ni ex vivo.

Enfermedades como la enfermedad del hígado graso pueden tener un impacto en la expresión zonada de las enzimas CYP y posiblemente también en la zonación de la función. Por ejemplo, los estudios experimentales y clínicos informan consistentemente que CYP3A4 está regulado negativamente en el hígado graso en términos de actividad, nivel de expresión o farmacocinética (PK)9,10,11,12,13. Por el contrario, la mayoría de los estudios en humanos y animales, aunque no todos, afirman que CYP2E1 está regulado positivamente en la esteatohepatitis no alcohólica en términos de actividad o expresión9,10,14,15,16. Por el contrario, también se observó en pacientes que CYP2E1 está regulado negativamente en términos de expresión de proteínas y ARNm17. Además, en ratas sometidas a una dieta deficiente en metionina colina (MCD), CYP2E1 se reguló negativamente en términos de actividad y expresión de ARNm12.

En conjunto, el impacto de la esteatosis en el metabolismo de los fármacos se discute de manera controvertida18 (consulte la Tabla complementaria S2 para obtener más detalles). Hasta ahora no se ha prestado mucha atención a una descripción clara de la gravedad, el tipo y la zonación de la acumulación de grasa. Es posible que estos factores afecten el patrón de expresión de CYP y/o la actividad de CYP y, en consecuencia, la función mediada por CYP, como la metabolización de fármacos.

El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar el impacto de la esteatosis periportal en el metabolismo pericentral de los fármacos centrándose en las importantes isoformas de CYP CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4. Nuestro estudio es único con respecto a relacionar la distribución zonal y el patrón de esteatosis con enzimas clave del metabolismo de los fármacos. Como se indicó anteriormente, la mayoría de los demás estudios sobre el metabolismo de los fármacos no tienen en cuenta este impacto potencial de la esteatosis (Materiales complementarios, Tabla S3). Además, se investiga la distribución zonal de las enzimas CYP o la actividad general y/o los niveles de expresión. En otras palabras, los estudios centrados en la distribución zonal del patrón de expresión de CYP no involucraron trastornos metabólicos hepáticos como el hígado graso y su impacto en el metabolismo de los fármacos mediado por CYP.

Por lo tanto, estudiar la zonación del CYP en la compleja relación entre la esteatosis y el metabolismo de los fármacos es un aspecto nuevo y desconocido. Sin embargo, este aspecto parece ser importante, ya que cada vez hay más evidencia de que los cambios morfológicos periportales, como la fibrosis, pueden afectar ciertas características del metabolismo de los fármacos ubicado pericentralmente8. Por tanto, nuestro estudio fue diseñado para investigar esta relación.

Por lo tanto, se indujo esteatosis periportal micro y macrovesicular mixta de diversos grados utilizando una dieta alta en grasas con contenido reducido de metionina colina (dieta HF). Para cuantificar la relación entre la esteatosis y el metabolismo de fármacos catalizado por CYP: en el primer paso, se caracterizó y cuantificó la esteatosis hepática. En el segundo paso, analizamos la distribución espacial de las enzimas metabolizadoras de fármacos. En el tercer paso, se evaluó la actividad de CYP ex vivo y se determinó la correlación entre la actividad y la gravedad de la esteatosis y el patrón de esteatosis. Finalmente, se realizó un estudio farmacocinético para evaluar la actividad de CYP in vivo basado en un cóctel de fármacos de midazolam para CYP3A4, cafeína para CYP1A2 y codeína para CYP2D619. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos a partir de las curvas de eliminación del fármaco y se analizó la asociación entre la gravedad y el patrón de esteatosis.

El protocolo de alimentación indujo predominantemente esteatosis periportal a mediozonal, pero no pérdida de peso. Curiosamente, observamos una distribución bastante heterogénea dentro y entre los lóbulos del hígado (para más detalles, consulte la figura complementaria S1).

En los animales alimentados durante 2 semanas, observamos un patrón de esteatosis mixto, pero predominantemente microvesicular. En el entorno inmediato del tracto porta, había un pequeño borde de hepatocitos con grandes vacuolas grasas. Sin embargo, la mayoría de los hepatocitos en la zona periportal externa y el área media zonal contenían gotitas de lípidos microvesiculares. Después de cuatro semanas de alimentación, se invirtió la relación entre el patrón de esteatosis microvesicular y macrovesicular. Los hepatocitos en la zona periportal y parte del área mediozonal estaban llenos de grandes vacuolas grasas. Por el contrario, había un borde bastante pequeño de hepatocitos en el área media al pericentral que contenía pequeñas vesículas lipídicas.

La aplicación de la dieta inductora de esteatosis provocó un aumento sustancial y significativo en la concentración media de TG por 100 mg de hígado homogeneizado. En los grupos experimentales, la concentración de TG fue al menos el doble que en el grupo de control. Observamos 192,7 nmol/100 mg de tejido como el valor más bajo en los dos grupos experimentales en comparación con una media de 99,6 ± 42,3 nmol/100 mg de tejido en el grupo control, lo que resultó en una diferencia altamente significativa entre los grupos control y experimental (p = 0,0002 ), consulte la figura 1A.

Gravedad de la esteatosis hepática. (A) Triglicéridos totales según la dieta. La medición de triglicéridos totales mostró niveles significativamente más altos en los grupos de dieta HF en comparación con el control, pero no hubo diferencias entre los grupos sometidos a dos o cuatro semanas de dieta HF; (B) Gotitas de lípidos, hepatocitos que contienen lípidos, hepatocitos microesteatóticos y hepatocitos macroesteatóticos según la dieta. El análisis de imágenes utilizando diferentes algoritmos detectó diferencias específicas en la gravedad al someter a los animales a 2 o 4 semanas de alimentación con la dieta especial. El análisis de las gotas de lípidos reveló una superficie significativamente mayor cubierta por las gotas. El análisis de patrones que evaluó la esteatosis micro y macrovesicular por separado reveló una superficie sorprendente y significativamente mayor cubierta por hepatocitos esteatósicos microvesiculares después de dos semanas de alimentación en contraste con la superficie significativamente mayor cubierta por hepatocitos esteatósicos macrovesiculares después de cuatro semanas de alimentación. La superficie total cubierta por hepatocitos esteatósicos fue similar en ambos grupos (*nivel de significancia < 0,05, **nivel de significancia < 0,01, ***nivel de significancia < 0,001, ****nivel de significancia < 0,0001, el tamaño de la muestra de cada grupo se muestra en la parte inferior de la barra).

La concentración media de TG en el hígado de los animales sometidos a cuatro semanas de alimentación fue mayor en comparación con los animales sometidos a dos semanas de alimentación (con 296,1 ± 91,6 nmol/100 mg de tejido después de cuatro semanas frente a 252,8 ± 43,0 nmol/100 mg tejido después de dos semanas, sin embargo, la diferencia entre los dos grupos experimentales no alcanzó significación estadística (p = 0,48).

Para la cuantificación histológica de la gravedad y el patrón de la esteatosis, aplicamos dos algoritmos de imagen diferentes.

Primero, analizamos la superficie relativa cubierta por las gotas de lípidos como se hace frecuentemente en la evaluación de la gravedad basada en análisis de imágenes20,21. En animales sometidos a dos semanas de alimentación, la superficie relativa cubierta por las gotitas de lípidos osciló entre el 8 y el 11%. Por el contrario, en los animales alimentados durante cuatro semanas, la superficie relativa cubierta por las gotitas de lípidos fue significativamente mayor (p = 0,001), aunque la diferencia absoluta en la "superficie relativa" no fue tan alta (9,3 ± 1,3% versus 13,9 ± 2,7%). %, ver figura 1B. Sin embargo, este tipo de análisis subestima el impacto de la esteatosis microvesicular, ya que incluso un gran número de hepatocitos con pequeñas vacuolas grasas no contribuye sustancialmente a la superficie relativa.

En segundo lugar, determinamos la superficie relativa cubierta por hepatocitos que contienen lípidos, un análisis más cercano a la evaluación histopatológica convencional aplicada clínicamente. Los médicos estiman el número relativo de hepatocitos que contienen gotitas de grasa, independientemente del tamaño22; se considera que < 33 % representa esteatosis leve, 33 a 66 % refleja esteatosis moderada y > 66 % indica esteatosis grave. En contraste con el modelo de rata23,24, el período de alimentación de 2 semanas ya indujo una esteatosis grave con una superficie relativa cubierta por hepatocitos cargados de grasa superior al 66%, ver Fig. 1B. Utilizando el algoritmo de reconocimiento de patrones para calcular el área total cubierta por hepatocitos cargados de grasa, la diferencia entre los dos grupos sometidos a 2 o 4 semanas de inducción no fue significativa, como ya se observó en el análisis de TG.

Sin embargo, utilizando este algoritmo de reconocimiento de patrones, pudimos discriminar entre esteatosis micro y macrovesicular. Como se describió anteriormente, el período de alimentación más corto se asoció con un patrón esteatótico predominantemente microvesicular. Aproximadamente el 48,6 ± 12,9 % de la superficie relativa estaba cubierta por hepatocitos esteatósicos microvesiculares, mientras que el 20,7 ± 7,1 % estaba cubierto por hepatocitos esteatósicos macrovesiculares, lo que representa una proporción de esteatosis micro y macrovesicular de 2,4:1. Por el contrario, el período de inducción más largo resultó en un patrón esteatótico predominantemente macrovesicular. Después de 4 semanas de alimentación, una proporción significativamente menor de la superficie relativa (33,4 ± 10,2%) estaba cubierta por hepatocitos esteatósicos microvesiculares, mientras que una proporción significativamente mayor estaba cubierta por hepatocitos esteatósicos macrovesiculares (39,9 ± 8,6%), lo que resultaba en una proporción de 0,8:1. En otras palabras, la proporción de esteatosis micro y macrovesicular cambió sustancialmente.

Este patrón refleja el desarrollo de esteatosis que comienza con la acumulación de pequeñas gotas de lípidos en el área periportal y se extiende hacia la zona pericentral. Con el tiempo y la acumulación de más grasa en los hepatocitos, las gotitas se hicieron más grandes, lo que resultó en una esteatosis macrovesicular, como se informó anteriormente25.

Como era de esperar, todas las enzimas CYP se expresaron en la región pericentral, aunque en diferente medida.

La tinción de CYP3A4 fue visible en las primeras 2-3 líneas de hepatocitos que rodean la vena central y una intensidad de señal moderada en el área pericentral del lóbulo. Al calcular la superficie relativa cubierta por señales fuertes y moderadas, no encontramos una diferencia en la superficie de CYP3A4 entre los tres grupos, ver Figs. 2 y 3.

Visualización de esteatosis y expresión de CYP en animales normales y experimentales sometidos a dos semanas respectivamente a cuatro semanas de dieta HF. (A) La tinción con HE muestra esteatosis periportal con un patrón predominantemente microvesicular después de dos semanas de alimentación y un patrón predominantemente macrovesicular después de cuatro semanas de alimentación; (B) Tinción con glutamina sintetasa (GS) para la anotación de hepatocitos pericentrales alrededor de la vena central y la discriminación de las zonas periportales y pericentrales; (C) Tinción de CYP3A4 presente en ubicación pericentral sin diferencias sustanciales en la distribución de señales positivas entre los tres grupos; (D) La tinción con CYP2D6 también está presente en la ubicación pericentral sin diferencias sustanciales en la distribución de señales positivas entre los tres grupos; (E) CYP2D6 se expresa casi en todos los lóbulos con 1 a 2 líneas de hepatocitos teñidos de color marrón oscuro alrededor de la vena central con un patrón similar en los tres grupos; (F) Expresión de CYP2E1 ligeramente diferente en comparación con CYP3A4 con 4-5 líneas de hepatocitos que presentan señales de fuerte intensidad alrededor de la vena central, sin diferencias tampoco entre grupos; Barra de escala 250 µm.

Cuantificación de la expresión CYP mediante el algoritmo de reconocimiento de patrones. (A – D) No hay diferencias significativas en el patrón de expresión de CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6 y CYP2E1 en términos de superficie relativa cubierta por hepatocitos teñidos positivamente; el tamaño de muestra de cada grupo se muestra en la parte inferior de la barra.

La expresión de CYP1A2 siguió un patrón similar al de CYP3A4 con una señal fuerte en las primeras 2-3 líneas de hepatocitos perivenosos y una señal moderada que se extiende por todo el tercio pericentral del lóbulo. En este caso tampoco el patrón y la extensión se vieron afectados por la dieta inductora de esteatosis, véanse las Figs. 2 y 3.

CYP2D6 se expresó casi en los lóbulos completos. Sin embargo, la intensidad de la señal fue más fuerte alrededor de la vena central. Observamos 1 o 2 líneas de hepatocitos teñidos de color marrón oscuro alrededor de la vena central. Los hepatocitos restantes mostraron una señal moderada en todos los lóbulos. El patrón CYP2D6 así como su extensión tampoco fueron afectados por la dieta inductora de esteatosis, ver Fig. 2 y 3.

El patrón de tinción de CYP2E1 fue ligeramente diferente en comparación con CYP3A4. Tanto en el grupo control como en el experimental, observamos 4-5 líneas de hepatocitos que presentaban señales de fuerte intensidad alrededor de la vena central. Además, para CYP2E1, el patrón y la extensión no se vieron afectados por la dieta inductora de esteatosis, ver Figs. 2 y 3.

La actividad de CYP en el tejido hepático se midió utilizando cuatro reacciones modelo que cubrían diferentes combinaciones de enzimas. Primero determinamos el contenido de proteína por gramo de hígado y luego relacionamos la actividad con los mg de proteína en el tejido. Observamos que el contenido relativo de proteína de las muestras de control normales osciló entre 67,4 y 79,2 mg/ml, ver Fig. 4A. Por el contrario, el contenido relativo de proteína de las muestras esteatósicas fue significativamente menor y osciló entre 64,0 y 69,2 mg/ml después de 2 semanas de alimentación y 62,2 a 69,2 mg/ml después de 4 semanas de alimentación.

Actividad del CYP. (A) La concentración de proteínas en muestras de hígado fue estadísticamente significativamente menor en muestras esteatósicas en comparación con el control, pero similar en los dos grupos experimentales; (B) La actividad de CYP3A determinada con el ensayo EMND fue significativamente menor en las muestras de animales con esteatosis grave según lo determinado por el análisis de gotitas de lípidos; (C) Los resultados del ensayo EROD para la actividad de CYP1A mostraron una actividad significativamente menor en las muestras de animales con esteatosis grave; (D) El ensayo PNPH para la actividad de CYP1E1 mostró una actividad creciente al aumentar la gravedad de la esteatosis (*nivel de significancia < 0,05, **nivel de significancia < 0,01, ***nivel de significancia < 0,001, ****nivel de significancia < 0,0001, tamaño de muestra de cada grupo mostrado en la parte inferior de la barra).

La duración de la alimentación tuvo un impacto en la actividad de CYP3A (ensayo EMND), CYP1A (ensayo EROD) y CYP2E1 (ensayo PNPH), ver Fig. 4, pero no en ECOD y PROD, ver Fig. S2. En el primer paso del análisis, exploramos el impacto de la duración de la alimentación en la actividad del CYP. La actividad de CYP3A medida por la reacción EMND así como la actividad de CYP1A determinada por la reacción EROD fueron significativamente menores en hígados de animales sometidos a 4 semanas de alimentación en comparación con el tejido de control de animales normales (p = 0,029, respectivamente p = 0,005), ver Fig. 4B,C. Por el contrario, la actividad de CYP2E1 fue casi el doble en los hígados obtenidos de animales después de una alimentación prolongada en comparación con el control (p = 0,0003), ver Fig. 4D.

La gravedad de la esteatosis afectó la actividad ex vivo de CYP1A2 y CYP2E1. En el segundo paso del análisis, utilizamos los resultados de las gotitas de lípidos de los animales individuales para calcular la correlación lineal entre la gravedad de la esteatosis y la actividad de CYP. Como se esperaba del primer análisis, encontramos una correlación negativa moderada entre la superficie relativa cubierta por las gotitas de lípidos y la actividad de CYP3A medida en el ensayo EMND, ver Fig. 5A1. Observamos una fuerte correlación negativa con la actividad de CYP1A (ensayo EROD), ver Fig. 5A2. También confirmamos la fuerte correlación positiva entre la gravedad de la esteatosis y la actividad de CYP2E1 según lo determinado en el ensayo PNPH, ver Fig. 5A3.

Correlación entre la gravedad de la esteatosis y la actividad de CYP. (Fila A) Gravedad de la esteatosis determinada mediante análisis de gotitas de lípidos en porcentaje de la superficie; (Fila B) Extensión de la esteatosis microvesicular, en porcentaje de la superficie; (Fila C) Grado de esteatosis macrovesicular, expresado en porcentaje. (Columna 1) Correlación del tipo y gravedad de la esteatosis con la actividad de CYP3A; (Columna 2) Correlación del tipo y gravedad de la esteatosis con la actividad de CYP1A; (Columna 3) Correlación del tipo y gravedad de la esteatosis con la actividad de CYP2E1. Control como círculos magenta, dieta HF de dos semanas como cuadrados azules, dieta HF de 4 semanas como triángulos verdes.

El patrón de esteatosis influyó en la actividad ex vivo de CYP1A y CYP2E1. En el tercer paso, analizamos la correlación entre el patrón predominante de esteatosis y la actividad de CYP. En contraste con el análisis de gotas, el grado de esteatosis microvesicular (%) no se correlacionó significativamente con los resultados de EMND y PNPH, lo que refleja principalmente la actividad de CYP3A y CYP2E1, ver Fig. 5B1, B3, pero mostró una correlación negativa moderada con el Actividad de CYP1A, ver Fig. 5B2. Además, el grado de esteatosis macrovesicular no se correlacionó significativamente con CYP3A, se correlacionó moderadamente con CYP1A, pero mostró una fuerte correlación positiva con la actividad de CYP2E1.

En conjunto, ciertas características de la esteatosis periportal tuvieron un fuerte impacto en la actividad de las enzimas CYP ubicadas en la zona pericentral del lóbulo hepático. La gravedad de la esteatosis se correlacionó negativamente con la actividad de CYP3A y CYP1A, pero positivamente con la actividad de CYP2E1. Además de la gravedad, el patrón de esteatosis también tuvo un impacto en la actividad del CYP. La esteatosis macrovesicular se correlacionó negativamente con la actividad de CYP1A pero se correlacionó positivamente con la actividad de CYP2E1. Estas observaciones sugieren una interacción muy compleja entre una alteración en la zona periportal y la respuesta molecular en la región pericentral.

Primero, observamos las curvas de eliminación de fármacos en los tres grupos experimentales. En segundo lugar, determinamos los parámetros farmacocinéticos, como el tiempo máximo, la concentración máxima y la vida media de todos los fármacos (consulte la Tabla complementaria S4) y comparamos el AUC de los grupos control y experimental. En tercer y cuarto lugar, investigamos el impacto de la gravedad de la esteatosis y el patrón de esteatosis en el AUC calculando la correlación lineal.

El análisis farmacocinético reveló una curva de eliminación exponencial similar para los tres compuestos, como se esperaba. La concentración máxima apareció entre 15 y 60 minutos y la eliminación del fármaco se produjo entre 4 y 6 h; consulte la figura 6; para los metabolitos, consulte la figura complementaria S4. El área sombreada ilustra el intervalo de credibilidad del 95% del análisis bayesiano. Los intervalos de credibilidad que no se superponen indican una diferencia significativa en la dinámica en este momento dado. Sin embargo, es difícil predecir un comportamiento general diferente cuando los intervalos de credibilidad se superponen parcialmente en el tiempo.

Curvas de eliminación de fármacos de los fármacos y metabolitos de prueba y el AUC correspondiente. (A) Midazolam; (B) Cafeína; (C) codeína; *nivel de significancia < 0,05, **nivel de significancia < 0,01, ***nivel de significancia < 0,001, ****nivel de significancia < 0,0001, tamaño de muestra de cada grupo mostrado en la parte inferior de la barra. Las líneas continuas son la media, las áreas sombreadas corresponden al intervalo de credibilidad del 95% del análisis bayesiano.

La duración de la alimentación tuvo un impacto en el AUC de los tres fármacos de prueba. Calculamos los parámetros farmacocinéticos y verificamos diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales. Para hacer declaraciones concluyentes sobre diferencias generales significativas entre condiciones, investigamos los valores de AUC como una medida agregada para los cursos de tiempo. Este parámetro abarca el tiempo hasta la concentración máxima, la concentración máxima (Cmax) y la vida media y, por lo tanto, parecía más adecuado para un análisis en profundidad.

Dos semanas de alimentación, que dieron como resultado una esteatosis predominantemente microvesicular, aceleraron la eliminación de cafeína como lo indica el AUC más pequeño. Curiosamente, los animales parecieron volverse de alguna manera “tolerantes” a este efecto ya que el AUC alcanzó niveles normales en los animales sometidos a cuatro semanas de esta dieta. Por el contrario, cuatro semanas de alimentación, que dieron como resultado una esteatosis predominantemente macrovesicular, desaceleraron la eliminación de midazolam y codeína, como lo indica el AUC más grande.

La gravedad de la esteatosis se correlacionó con el AUC de midazolam y codeína. A continuación, analizamos las correlaciones entre la gravedad de la esteatosis de animales individuales, independientemente del momento de la alimentación, con el AUC correspondiente; consulte la Fig. 7 para los fármacos originales y las Figs. S5, S6 y S7 en el suplemento de metabolitos. La gravedad de la esteatosis mostró una correlación positiva moderada con el AUC del midazolam y la codeína, lo que sugiere una eliminación desacelerada de ambos fármacos de prueba, ver también la Fig. 7, fila A y fila C. Como se esperaba, según los resultados del análisis de grupo, no encontramos una correlación entre la gravedad de la esteatosis microvesicular de aparición transitoria y el AUC de los tres fármacos de prueba, ver Fig. 7, fila B.

Correlación entre la gravedad de la esteatosis y el AUC (AC). (Fila A) Gravedad de la esteatosis determinada mediante análisis de gotitas de lípidos en porcentaje de la superficie; (Fila B) Extensión de la esteatosis microvesicular, en porcentaje de la superficie; (Fila C) Grado de esteatosis macrovesicular, expresado en porcentaje. (Columna 1) Correlación del tipo de esteatosis y su gravedad con el AUC de midazolam; (Columna 2) Correlación del tipo de esteatosis y su gravedad con el AUC de la cafeína; (Columna 3) Correlación del tipo y gravedad de la esteatosis con el AUC de la codeína. Control como círculos magenta, dieta HF de dos semanas como cuadrados azules, dieta HF de cuatro semanas como triángulos verdes.

El patrón de esteatosis también se correlacionó con el AUC de midazolam y codeína. Se obtuvieron resultados similares al correlacionar los patrones de esteatosis con el AUC. El patrón de esteatosis macrovesicular mostró una correlación positiva moderada con el AUC de midazolam y codeína, lo que sugiere una eliminación desacelerada de midazolam y codeína, ver Fig. 7, fila A y fila C.

Para proporcionar una descripción general concisa de los principales resultados y las asociaciones observadas, realizamos un análisis de correlación sistemático, ver Fig. 8.

Análisis de correlación. Matriz de correlación basada en la correlación de Pearson con correlación positiva en azul y correlación negativa en rojo. Las áreas del círculo son proporcionales al coeficiente de correlación. Los niveles de significancia son *0,05, **0,01 y ***0,001, con valores de p ajustados para pruebas múltiples utilizando Benjamini y Hochberg. Las funciones se han ordenado por categoría.

En resumen, (a) las variables correspondientes a la esteatosis mostraron todas una correlación positiva altamente significativa entre sí (gotas de lípidos, esteatosis microvesicular, esteatosis macrovesicular, contenido de triglicéridos). (b) no se pudieron observar correlaciones significativas entre las variables de esteatosis y la distribución de la expresión de CYP como lo indica la superficie cubierta de CYP3A4 y CYP1A2, mientras que existió una pequeña correlación positiva en el caso de CYP2E1. (c) El contenido de proteínas mostró una fuerte asociación negativa con los parámetros de esteatosis. (d) La actividad de CYP medida mediante EROD (CYP1A) y EMND (CYP3A) mostró una asociación negativa con los parámetros de esteatosis, mientras que PNHP (CYP2E1) mostró una fuerte asociación positiva. (e) Las gotitas de lípidos y la macroesteatosis se correlacionaron positivamente con el AUC de midazolam y codeína.

Nuestro estudio arrojó cuatro hallazgos novedosos. (1) La inducción dietética utilizando una dieta rica en grasas con bajo contenido de metionina dio como resultado una esteatosis periportal mixta, distribuida heterogéneamente por todo el hígado. (2) La gravedad y el patrón de esteatosis periportal no se asociaron con cambios en la distribución zonal y el grado de expresión de CYP. (3) La gravedad y el patrón de esteatosis periportal se asociaron con cambios en la actividad ex vivo de CYP1A, CYP3A y CYP2E1. (4) La gravedad y el patrón de esteatosis periportal se asociaron con cambios en la farmacocinética de la cafeína (CYP1A2) y midazolam (CYP3A4), pero no de la codeína (CYP2D6).

Estábamos interesados ​​en estudiar el impacto de una distribución zonada de esteatosis claramente definida en los procesos ubicados pericentralmente. Por lo tanto, seleccionamos un modelo dietético de esteatosis periportal para investigar el efecto sobre el metabolismo de los fármacos, uno de los procesos clave que tiene lugar en la zona pericentral.

Utilizamos una dieta rica en grasas con metionina y colina reducidas para inducir la esteatosis hepática periportal. Al utilizar esta dieta en ratas, se desarrolló esteatosis periportal una semana después de la alimentación26. La extensión a la región media se observó dos semanas después de la alimentación. Se indujo una esteatosis grave que se extendió desde la región periportal hasta la pericentral dentro de las cuatro semanas posteriores a la alimentación. Por el contrario, los ratones reaccionaron más lentamente a este protocolo de inducción, como se esperaba según una revisión reciente de Zhong27. Concluyó que las ratas eran más susceptibles a una dieta rica en grasas que los ratones, como lo indica una progresión más rápida de las alteraciones histológicas. de las alteraciones histológicas.

Además, los ratones mostraron un patrón de esteatosis ligeramente diferente en comparación con las ratas. Los ratones no solo mostraban esteatosis macrovesicular sino también esteatosis microvesicular. Este patrón microvesicular fue más pronunciado después de dos semanas en comparación con cuatro semanas de alimentación. Este hallazgo está en línea con el concepto de que la esteatosis parece desarrollarse a partir de la acumulación de pequeñas gotas de lípidos (esteatosis microvesicular) en unos pocos hepatocitos25,28. En algún momento, las microvesículas se fusionan para formar una gran vacuola que le da al hepatocito cargado de grasa la típica apariencia de anillo de sello. Por tanto, se considera que la esteatosis macrovesicular es el resultado de un proceso bastante crónico.

Sin embargo, existen otras razones para la esteatosis microvesicular. La esteatosis microvesicular puede ocurrir como resultado de una agresión aguda o tóxica al hígado29. También se observa en el contexto de lesión hepática inducida por fármacos30. Según Silva, la esteatosis microvesicular puede desarrollarse debido a un deterioro de la beta-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos, lo que sugiere un trastorno mitocondrial31 que potencialmente afecta la función metabólica.

La clasificación de la gravedad de la esteatosis hepática siguió cuatro enfoques complementarios. La cuantificación bioquímica de TG y la cuantificación de la superficie relativa de los hepatocitos cargados de grasa discriminaron claramente entre hígados normales y esteatósicos. La discriminación entre los dos protocolos de inducción de esteatosis fue posible mediante el análisis de gotas de lípidos. El análisis de las gotitas de lípidos se utiliza con frecuencia24,32,33,34 y se basa en la identificación del área blanca de las gotitas de lípidos en comparación con el área restante. Sin embargo, en el caso de la esteatosis microvesicular, la precisión se ve dificultada, ya que las pequeñas gotas no pueden identificarse de forma inequívoca. Por lo tanto, decidimos entrenar el algoritmo de reconocimiento de patrones para la cuantificación de la micro y macroesteatosis por separado, un enfoque comparable22,35 pero más preciso que el diagnóstico clínico de rutina. La evaluación patológica de la gravedad se basa en la estimación del porcentaje relativo de hepatocitos con una gotita de lípidos22,36. Sin embargo, los patólogos también deben informar la distribución zonal (esteatosis periportal versus pericentral) y el patrón de esteatosis (esteatosis macrovesicular versus microvesicular), pero solo de manera cualitativa.

Nuestro estudio reveló tres nuevas observaciones que aclaran el impacto de la esteatosis periportal en el metabolismo de los fármacos, que merecen mayor atención. Como se describió anteriormente, la esteatosis periportal no afectó el patrón de expresión pericentral de las cuatro enzimas CYP clave que se estudiaron. Sin embargo, la esteatosis periportal afectó la actividad de CYP1A, CYP2E1 y CYP3A. La esteatosis periportal también afectó la farmacocinética de la cafeína (CYP1A2) y midazolam (CYP3A4), pero no de la codeína (CYP2D6).

El impacto del patrón de esteatosis o la distribución zonal en el nivel y la distribución de expresión de CYP no está bien investigado. Ninguno de los estudios publicados sobre el metabolismo de los fármacos reveló estas características (Materiales complementarios, Tablas S1 y S2) al describir sus resultados. Curiosamente, no observamos ningún efecto de la esteatosis, independientemente de su gravedad o patrón, sobre la distribución de la expresión de la proteína CYP. Otros estudios informaron una disminución del nivel de expresión en hígados esteatósicos de pacientes humanos17, ratas12,37 y ratones38, como lo demuestra la transferencia Western o qPCR (Materiales complementarios, Tabla S3). Sin embargo, no investigaron el alcance de la distribución zonal mediante inmunohistoquímica. Es posible que la zonación no se vea afectada, pero los niveles totales de expresión de ARNm y proteínas pueden reducirse en un hígado con esteatosis grave. Para aclarar esta cuestión, se necesitan técnicas complementarias. La distribución espacial debe visualizarse y cuantificarse mediante inmunohistoquímica, y la proteína, respectivamente, la expresión de ARNm debe cuantificarse mediante Western blot o qPCR.

Sin embargo, los cambios en los niveles de ARNm no necesariamente reflejan cambios en los niveles de proteínas y pueden no predecir la actividad de las proteínas debido a procesos regulatorios postranscripcionales, traduccionales y postraduccionales39.

Observar el mecanismo subyacente a los procesos reguladores de la expresión de CYP y tener en cuenta la distribución y la actividad añade mayor complejidad. Por ejemplo, la regulación positiva de CYP2E1 en la enfermedad del hígado graso se atribuye a un mecanismo diferente, como se resume en una revisión reciente de Massart et al.40. En la enfermedad hepática alcohólica, se cree que los niveles más altos de CYP2E1 son el resultado de la inhibición de la degradación por el etanol. El mecanismo de la enfermedad del hígado graso no alcohólico es menos claro. Se postuló un círculo vicioso, que comienza con niveles elevados de ácidos grasos y resistencia a la insulina que promueven la expresión de CYP2E1. A cambio, los niveles elevados de CYP2E1 pueden inducir peroxidación lipídica, daño oxidativo y agravar la resistencia a la insulina, lo que aumenta la acumulación de grasa en el hígado.

Sin embargo, los estudios que informaron sobre el impacto de la esteatosis en los niveles de expresión de CYP utilizaron otros modelos animales de esteatosis, un factor que también afecta la comparabilidad de los resultados. Stärkel et al. observaron en ratas alimentadas con MCD una disminución en la expresión y actividad de CYP2E112. Por el contrario, Zhang et al. utilizaron el modelo de dieta HF y observaron una actividad reducida y expresión de ARNm de las enzimas de fase I CYP1A2, CYP2B1, CYP2C11, CYP3A1 y CYP4A1. Curiosamente, no observó ningún impacto en la expresión de CYP2E1 en el hígado de ratas obesas37 (Material complementario, Tabla S3).

En conclusión, la regulación de los niveles de expresión, distribución y actividad de CYP en la esteatosis parece ser bastante compleja ya que podría estar relacionada con la etiología o el modelo animal utilizado.

Sin embargo, existen determinadas patologías hepáticas en las que la zonación y la intensidad de la tinción de la proteína CYP se ven afectadas por la enfermedad hepática subyacente. Este es obviamente el caso cuando la vitalidad de los hepatocitos pericentrales se ve afectada, como ocurre comúnmente después de una intoxicación. La lesión hepática tóxica inducida por CCl4 con necrosis pericentral provocó una disminución en la expresión y la intensidad de la tinción de las proteínas CYP19. Sin embargo, también puede producirse una alteración de la expresión de CYP en el caso de deterioro morfológico periportal. El mejor ejemplo es el estudio de Ghallab que observó una pérdida de expresión de CYP no sólo en el caso de la fibrosis pericentral sino también en el caso de la fibrosis periportal8. Pero el daño morfológico no es necesariamente un requisito previo para una expresión alterada de CYP. A pesar de la morfología normal, se observó una pérdida selectiva de la expresión de proteínas y ARNm de CYP1A en un modelo de ratón con hipoxia crónica intermitente que imita la apnea del sueño41.

Estas observaciones sugieren que eventos celulares o moleculares en la región periportal podrían resultar en una respuesta molecular de las células en las regiones pericentrales. Como se mencionó anteriormente, Ghallab postuló que en el caso de la fibrosis periportal los mediadores inflamatorios podrían provocar la respuesta celular de los hepatocitos ubicados pericentralmente, similar a la observada en el caso de la fibrosis pericentral8.

La esteatosis periportal tuvo un impacto en la actividad de enzimas CYP seleccionadas, aunque el patrón de expresión se mantuvo sin cambios. Aquí observamos que la actividad de las familias CYP1A y CYP3A en el tejido hepático estaba regulada a la baja con una gravedad cada vez mayor, mientras que la actividad de CYP2E1 estaba regulada al alza. Estas observaciones están en línea con los hallazgos de otros grupos, como se resume en una revisión reciente de Cobbina18 y se confirman aún más con el análisis de la literatura presentado (Material complementario, Tabla S3). Sin embargo, estos estudios se centraron en el impacto de la esteatosis en sí, pero no investigaron diferentes gravedades, patrones o distribución zonal.

La actividad de las enzimas de la familia CYP3A estaba disminuida en el caso de la esteatosis, incluso entre especies: en humanos con EHNA17,42,43, así como en ratones sometidos a HFD42 y ratas44. De manera similar, otros también observaron que la actividad de las enzimas de la familia CYP1A estaba disminuida, nuevamente en humanos17 y ratas37, pero aún no en ratones.

Pocos estudios investigaron la modulación de la actividad CYP2E1 relacionada con la esteatosis. La mayoría de los estudios centrados en CYP2E1 investigaron la expresión de ARNm o proteínas. Curiosamente, la actividad de CYP2E1 parece estar relacionada con el régimen dietético. Stärkel comparó dos modelos dietéticos diferentes y observó una mayor actividad cuando se aplicaba ácido orótico al 5%, pero una actividad reducida cuando se alimentaba a los animales con una dieta MCD durante 2 a 6 semanas12. En el último caso, la inflamación pronunciada concomitante parecía tener un impacto negativo en la actividad.

En nuestro análisis, correlacionamos el alcance de la esteatosis microvesicular, respectivamente, macrovesicular con la actividad de CYP y observamos diferencias sorprendentes entre los dos patrones con respecto a la actividad de CYP2E1. La esteatosis microvesicular no afectó la actividad de CYP2E1. Por el contrario, la esteatosis predominantemente macrovesicular se correlacionó positivamente con la actividad de CYP2E1. Este hallazgo contrasta con el de Stärkel, quien describió una regulación negativa de CYP2E1 después de inducir esteatosis macrovesicular en ratas sometidas a la dieta MCD12. Con base en estas observaciones, es necesario definir mejor el papel de la etiología, el patrón de esteatosis o la inflamación concomitante.

Sin embargo, estas consideraciones están limitadas por la dificultad de distinguir y evaluar las actividades enzimáticas correspondientes a la expresión de cada isoforma. Sin embargo, se debe seguir de cerca la distribución zonal en la expresión de cada isoforma en ratones para aclarar la relación con la gravedad de la esteatosis. Se sabe poco sobre la eventual reactividad cruzada de los anticuerpos isoforma utilizados.

Por el contrario, uno de los cinco ensayos de actividad mide predominantemente la actividad de una isoforma, como se muestra en la Tabla 3 modificada. El ensayo PNPH evalúa predominantemente la actividad de una isoforma única, la CYP 2E1. El ensayo EROD evalúa la actividad de la subfamilia 1A con su isoforma principal 1A2. El ensayo PROD se utiliza para evaluar la actividad de la familia CYP2B con las isoformas clave 2B6 y 2B1. Por el contrario, el ensayo EMND es más amplio y cubre la subfamilia CYP3A con sus isoformas principales 3A4, 3A1 y 3A2 y otras isoenzimas como Cyp3a11, 3a13 y 3a1645. El ensayo ECOD también es bastante amplio al medir la actividad combinada de las isoformas 1A1, 1A2, 2A1, 2A6, 2B1, 2B6, 2C9 y 2C11.

Además, el fármaco de prueba midazolam, habitualmente utilizado, también es metabolizado por otras isoenzimas CYP que pertenecen a otras subfamilias46.

Por lo tanto, es realmente difícil atribuir claramente las actividades enzimáticas a la expresión de cada isoforma y relacionarla con la gravedad de la esteatosis.

Sin embargo, podemos aclarar para CYP2E1 que el patrón de expresión no se vio afectado por la esteatosis, mientras que la actividad se correlacionó positivamente con la gravedad de la esteatosis alcanzando una alta significación (p <0,001), al comparar muestras severamente esteatósicas con muestras de control. Asimismo, podemos afirmar que el patrón de expresión de CYP1A2 fue similar en los tres grupos, mientras que la actividad se correlacionó negativamente con la gravedad de la esteatosis alcanzando una significación moderada al comparar muestras severamente esteatósicas con muestras control. Sin embargo, no investigamos los niveles de expresión de proteínas zonales de cada isoforma en el hígado de ratón, como se hizo en un estudio técnicamente muy desafiante de Tachikawa et al.47.

También investigamos el impacto de la gravedad y el patrón de esteatosis en la farmacocinética de tres fármacos de prueba. Observamos diferentes efectos de cada fármaco. La comparación de nuestros resultados con otros estudios es difícil ya que la mayoría de ellos no caracterizan la esteatosis con gran detalle. Sin embargo, en estudios previos38,42,48,49,50, el impacto de la esteatosis en el metabolismo de los fármacos ha sido discutido de manera controvertida. Esto sugiere que una multitud de factores además de la presencia o ausencia de esteatosis pueden influir en el metabolismo de los fármacos.

La esteatosis predominantemente microvesicular pareció acelerar la farmacocinética de la cafeína como lo indica el AUC más pequeño. Sin embargo, este efecto fue transitorio. Una vez que los animales desarrollaron esteatosis predominantemente macrovesicular, la eliminación se desaceleró hasta volver a la normalidad, como lo indica el AUC estadísticamente significativamente mayor. Por el contrario, utilizando un modelo con una esteatosis macrovesicular aún más grave en ratones ob/ob alimentados con una dieta MCD, Li informó un AUC significativamente mayor para la cafeína en comparación con el control38. Según estas observaciones, el metabolismo de la cafeína que refleja la actividad de CYP1A2 parece verse fuertemente afectado por el patrón de esteatosis con efectos opuestos.

Por el contrario, la farmacocinética del midazolam y la codeína no se vio afectada por la esteatosis microvesicular. Sin embargo, en el caso de esteatosis predominantemente macrovesicular, la eliminación de midazolam se desaceleró, como lo indica el AUC significativamente mayor en comparación con el grupo con esteatosis microvesicular. Utilizando un protocolo de inducción de esteatosis diferente, Li y colaboradores no observaron un impacto de la esteatosis en la eliminación de midazolam38. Por el contrario, Woolsey y colaboradores informaron que la esteatohepatitis no alcohólica inducida en humanos provocó un aumento en el AUC del midazolam y un retraso en la tasa de eliminación42. Sin embargo, no informaron ninguna información sobre el patrón de zonificación y distribución de la esteatosis. Estos resultados sugieren que no sólo la especie y el patrón podrían influir, sino también la etiología de la esteatosis.

En nuestro estudio, la esteatosis periportal no mostró un impacto en la tasa de eliminación de codeína inyectada por vía intraperitoneal indicativa de CYP2D6. En un modelo de rata alimentada con una dieta que contenía ácido orótico al 1 %, la esteatosis grave indujo un impacto significativo en el AUC y la tasa de eliminación del metoprolol administrado por vía oral (sustrato farmacológico de CYP2D6). Sin embargo, este efecto no fue evidente cuando se inyectó metoprolol por vía intravenosa50. Esta observación sugiere que también la vía de administración puede marcar la diferencia. En nuestro análisis estadístico, observamos una correlación moderada, por un lado, entre la gravedad y el alcance de la esteatosis macrovesicular y el AUC del midazolam y la codeína. Por el contrario, no observamos una correlación entre el patrón de gravedad de la esteatosis y el AUC de la cafeína. Además, la esteatosis microvesicular no mostró correlación con el AUC de ninguno de los tres fármacos de prueba. Estos resultados respaldan que la gravedad y el patrón son factores relevantes que influyen en parámetros seleccionados del sistema de metabolismo de los fármacos.

Nuestros resultados sugieren una complejidad mucho mayor con respecto a la interrelación de la esteatosis y el metabolismo de los fármacos. Hasta donde sabemos, este estudio es el primer informe que observa que el metabolismo de los fármacos no solo está influenciado por la presencia de esteatosis sino también relacionado con la gravedad y el patrón de acumulación de grasa. Aunque la esteatosis no afectó el patrón de distribución, la gravedad de la esteatosis macrovesicular periportal se correlacionó con la actividad de las enzimas CYP expresadas pericentralmente y la correspondiente eliminación del fármaco representada por el AUC.

En consecuencia, la regulación de la actividad de las enzimas CYP localizadas pericentralmente podría estar influenciada por factores más allá de la presencia o ausencia de grasa en los hepatocitos pericentrales, lo que sugiere algún mecanismo de señalización como el postulado por Ghallab en caso de fibrosis periportal8.

Como se mencionó anteriormente, este hallazgo se asemeja al hallazgo reciente de Ghallab y colaboradores mencionado en la introducción8, de que la fibrosis periportal afectó la zonificación metabólica de manera similar a la fibrosis pericentral. En otra publicación51 propusieron una supresión de las redes de genes metabólicos asociada a la inflamación en la enfermedad hepática aguda y crónica. Además, observaron que diferentes tipos de estímulos inflamatorios agudos y crónicos activaban las mismas redes reguladoras de genes. La regulación positiva de los genes inflamatorios se produjo simultáneamente con la regulación negativa de los genes metabólicos. Esto es lo que Ramadori y Christ denominaron “Economía molecular de la reacción de fase aguda hepática”52. Suponer que incluso la esteatosis hepática sin esteatohepatitis pronunciada representaría un estímulo inflamatorio leve podría explicar nuestra observación de que la esteatosis periportal afecta la actividad de ciertas enzimas CYP. Sin embargo, el hecho de que el metabolismo de los fármacos pueda verse alterado incluso en ausencia de alteraciones morfológicas, como se observa en el modelo murino de hipoxia crónica intermitente, podría hablar a favor de otros mecanismos de señalización41.

Estas observaciones exigen investigaciones más exhaustivas sobre el metabolismo de los fármacos y los posibles mecanismos de señalización intralobulares. En estudios futuros, la evaluación del metabolismo de los fármacos debería incluir todos los aspectos, incluida la distribución de la enzima CYP, el nivel de expresión, la actividad y la farmacocinética. En términos de esteatosis, no sólo se debe tener en cuenta la etiología, la gravedad, el tipo y la distribución zonal de la acumulación de grasa, sino también los mediadores inflamatorios u otras moléculas de señalización. Esto podría ayudar a comprender mejor los controvertidos resultados observados actualmente.

Se alimentaron ratones macho C57BL6/J durante dos o cuatro semanas con una dieta alta en grasas y baja en metionina y colina (dieta HF). A diferencia de la dieta deficiente en metionina-colina (MCD), este protocolo dietético induce inducción periportal. esteatosis en ratas y ratones, pero no provoca pérdida de peso23,24,26,35. El grupo de control recibió una dieta de mantenimiento estándar, lo que resultó en tres grupos experimentales (n = 4–6/grupo).

La esteatosis hepática se caracterizó histológicamente con respecto al patrón (micro versus macrovesicular), distribución zonada (periportal versus pericentral) y gravedad. La gravedad de la esteatosis se evaluó basándose en un ensayo de triglicéridos y una evaluación cuantitativa automatizada por computadora mediante escaneos de portaobjetos completos.

La distribución espacial de cuatro enzimas metabolizadoras de fármacos (CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4) se visualizó mediante inmunohistoquímica. La actividad de CYP se determinó utilizando cinco reacciones modelo en un ensayo fotométrico o fluorométrico. La farmacocinética se evaluó mediante un cóctel de fármacos compuesto por cafeína, midazolam y codeína. La inyección del cóctel de fármacos fue seguida por una muestra de microsangre en diez puntos de tiempo programados durante seis horas y un posterior análisis por cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS/MS)Experimento con animales.

Todos los estudios in vivo se llevaron a cabo con ratones macho C57BL6/J (Janvier, Francia), de 28 a 30 g de peso corporal, de entre ocho y diez meses de edad (excriadores) (n = 4 a 6/grupo). Los ratones fueron alojados aleatoriamente en grupos de tres animales y tuvieron libre acceso a comida y agua. Las jaulas se mantuvieron en condiciones ambientales constantes con un ciclo de luz/oscuridad de doce horas en una instalación animal convencional, temperatura ambiente constante (21 ± 2 °C) y 45-65% de humedad relativa.

Los ratones se sometieron a 2 o 4 semanas de alimentación con la misma dieta HF (E15652-94 EF R/M, mod MCD alto en grasas, Ssniff Spezialdiäten GmbH, Sulzfeld, Alemania) para inducir esteatosis de diferente gravedad (para más detalles en el composición, consulte la Tabla complementaria S5). El grupo de control de ratones recibió la dieta de mantenimiento estándar (Altromin Spezialfutter GmbH, Alemania). Se controló diariamente el aumento de peso corporal y la ingesta de alimentos.

El cóctel de fármacos constaba de cafeína, midazolam y codeína (2 mg/kg de peso corporal (bwt), 5 mg/kg de peso corporal y 2 mg/kg de peso corporal, respectivamente) y se utiliza ampliamente en estudios farmacocinéticos19, consulte la Tabla 1. Cada El fármaco se diluyó en 200 µl de agua estéril dando como resultado una concentración de 1 mg/ml para midazolam y codeína, y 2,5 mg/ml para cafeína. Se mezclaron las tres alícuotas dando como resultado un volumen total de 600 µl. El volumen a aplicar (180 µl/30 g de peso corporal) se calculó en función del peso corporal de cada ratón.

El cóctel de fármacos se administró mediante inyección intraperitoneal. Preferimos este método en comparación con la inyección oral o intravenosa por tres razones: primero, para reducir el estrés del animal causado por la alimentación forzada; en segundo lugar, reducir el riesgo de complicaciones tras la inyección intravenosa en la vena del pene; en tercer lugar, reducir el riesgo de contaminación del fármaco tras la inyección y la toma de muestras en el mismo sitio, lo que podría causar resultados falsos positivos en la vena de la cola53.

Los animales se sometieron a micromuestras de sangre repetidas en diez momentos programados durante seis horas (antes de la inyección, 15 min, 30 min, 1 h (h), 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h). ). Se recogieron muestras de la vena de la cola utilizando tubos capilares de extremo a extremo calibrados y heparinizados (Minicaps, Hirschmann) con un volumen de 9 µl (precisión del 0,5%, CV <1%). Los animales fueron sacrificados 24 h después de inyectar el cóctel de fármacos utilizando una sobredosis de isoflurano con desangramiento.

Se recogieron muestras de tejido hepático de cuatro lóbulos hepáticos diferentes (lóbulo lateral izquierdo, lóbulo mediano derecho, lóbulo superior derecho y lóbulo caudado inferior) y se sometieron a fijación con formalina e inclusión en parafina o se congelaron rápidamente y se criopreservaron a -80 °. C hasta su uso.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas vigentes para el bienestar animal y las Directrices ARRIVE para informar sobre investigaciones con animales. El protocolo de experimento con animales fue aprobado por Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Alemania (Número de aprobación: UKJ-19-020).

Las muestras fijadas con formalina se incluyeron en parafina. Se utilizaron bloques para preparar secciones de 3 µm. Las secciones se sometieron a tinción con HE para evaluar la esteatosis. Se utilizaron otras secciones para inmunohistoquímica para determinar la distribución espacial de cuatro enzimas CYP diferentes. Las secciones teñidas se digitalizaron utilizando un escáner de diapositivas completo (L11600, Hamamatsu, Japón) equipado con el software de visualización de imágenes NDP.view2Plus (Versión U12388-02) con un aumento de 40 ×.

La esteatosis se evaluó cualitativamente en términos de tipo y distribución en imágenes de diapositivas completas de secciones HE. Diferenciamos entre esteatosis micro y macrovesicular y el patrón mixto según el tamaño de las gotitas de lípidos en los hepatocitos. Además, discriminamos entre patrones de zonificación como esteatosis periportal, mediozonal y pericentral. También observamos la distribución intrahepática de la esteatosis analizando una sección de cada uno de los cuatro lóbulos del hígado.

Para determinar la gravedad de la esteatosis, analizamos secciones de los cuatro lóbulos hepáticos diferentes del mismo animal para aumentar el tamaño relativo de la muestra. Calculamos la gravedad media de la esteatosis en función de la superficie total cubierta por los lóbulos individuales (superficie relativa cubierta por gotitas de lípidos, respectivamente, por esteatosis macro y microvesicular).

El alcance y la gravedad de la esteatosis se cuantificaron utilizando Histokat, un software propietario basado en un algoritmo de aprendizaje automático creado por Fraunhofer MEVIS. El algoritmo divide el escaneo completo de la diapositiva en pequeños mosaicos cuadrados de un tamaño determinado. Utilizando un mínimo de 30 mosaicos por imagen de los cuatro lóbulos hepáticos diferentes en una sección y diferentes imágenes representativas de la serie, el software fue entrenado para reconocer eventos individuales como las gotas de lípidos (algoritmo de reconocimiento de eventos) o ciertos patrones (algoritmo de reconocimiento de patrones). .

Primero, evaluamos el número y la superficie relativa en la imagen cubierta por gotas de lípidos, independientemente de su tamaño, ver Fig. 9B,C. Para un hígado normal, consulte la Fig. 9A. En segundo lugar, utilizamos el algoritmo de reconocimiento de patrones (clasificación genérica 128) para cuantificar la superficie relativa cubierta por hepatocitos cargados de grasa. En segundo lugar, determinamos la superficie relativa cubierta por hepatocitos esteatósicos microvesiculares y el área cubierta por hepatocitos esteatósicos macrovesiculares. La suma de ambos dio como resultado la superficie total cubierta por hepatocitos esteatóticos, ver Fig. 9E, F. Para un hígado normal, consulte la Fig. 9D.

Análisis de imágenes de una exploración de diapositivas completa con secciones de cuatro lóbulos hepáticos diferentes utilizando el algoritmo de reconocimiento de patrones y reconocimiento de eventos Histokat; (A) Imagen superpuesta del hígado normal después de la codificación de colores de las gotitas de lípidos en amarillo; (B,C) Imagen superpuesta del hígado esteatósico después de la codificación de colores de las gotitas de lípidos en amarillo; (D) Imagen superpuesta del hígado normal después de codificar por colores los diferentes patrones que se van a cuantificar; (E,F) Imagen superpuesta del hígado esteatósico después de codificar por colores los diferentes patrones que se van a cuantificar. Baldosas cuadradas clasificadas en tres clases de colores (naranja para la esteatosis microvesicular, amarillo para la esteatosis macrovesicular y rojo para los hepatocitos no esteatósicos, excluida la luz de los vasos); (G) Imágenes superpuestas del hígado normal después de codificar por colores la visualización inmunohistoquímica de la expresión de CYP3A4; (H,I) Imágenes superpuestas de hígado esteatósico después de codificar por colores la visualización inmunohistoquímica de la expresión de CYP3A4. Azulejos cuadrados clasificados en dos clases de colores (azul para los hepatocitos CYP negativos o ligeramente teñidos y rojo para los hepatocitos teñidos de CYP de fuerte a moderado).

La inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejido hepático incluidas en parafina y fijadas con formalina de 3 µm de espesor. Se utilizaron diferentes anticuerpos CYP para la detección de CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1 y GS (consulte la Tabla 2). Las secciones de tejido hepático se desparafinaron y rehidrataron utilizando grados descendentes de etanol. Luego, la recuperación del antígeno se realizó con tampón citrato trisódico (Ph6.1) usando un vaporizador durante 30 minutos a 100 °C, seguido de enfriamiento durante 20 minutos. Se aplicó bloqueo de peroxidasa a la sección de tejido para bloquear la peroxidasa endógena. Se utilizó un bloque de proteínas listo para usar (ab64226, Abcam, Alemania) para bloquear la IgG endógena. Las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo CYP respectivo durante la noche a 4 °C, consulte la Tabla 2. En el caso de los anticuerpos primarios policlonales de conejo (CYP3A4, CYP2D6 y CYP2E1), las señales se amplificaron aplicando el sistema de detección IHC HRP/DAB específico para conejos. (ab236469, Abcam) durante 40 min a temperatura ambiente. En el caso de los anticuerpos primarios monoclonales de ratón (CYP1A2 y GS), los anticuerpos se biotinilaron primero utilizando el anticuerpo primario Dako Animal Research Kit Peroxidasa para ratón (K3954, Dako, Dinamarca). En este caso, se realizó un bloqueo adicional utilizando el kit de bloqueo Avidin/Biotin (ab64212, Abcam) antes de aplicar el primer anticuerpo biotinilado. Posteriormente, se añadió el complejo Avidin-HRP.

La visualización de la reacción se logró aplicando el cromógeno DAB durante (3 a 5) minutos también a temperatura ambiente. La contratinción se realizó con hematoxilina Dako (CS700, Dako, Dinamarca) durante 6 minutos. Se añadió un portaobjetos de control de reactivo negativo en cada ejecución utilizando los mismos procedimientos sin aplicar el anticuerpo primario.

Para la evaluación cualitativa, determinamos la distribución zonal y discriminamos entre la localización periportal, mediazonal y pericentral de la señal CYP. La intensidad de la señal se clasificó como leve, moderada o fuerte.

Para la cuantificación de la señal de CYP, utilizamos los mismos 128 algoritmos genéricos que para la esteatosis para determinar la superficie relativa cubierta por una señal de CYP determinada, consulte la Fig. 9H, I. Para un hígado normal, consulte la Fig. 9G.

La concentración de TG hepática se midió mediante un método colorimétrico utilizando un kit de ensayo cuantitativo de TG de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ab65336 Abcam, Alemania). Los lípidos se extrajeron de 100 mg de tejido hepático congelado rápidamente homogeneizando muestras de tejido hepático en 1 ml de solución de Igepal al 5 %/agua bidestilada con un mortero. Las muestras se calentaron lentamente en un termomezclador a 95 °C durante 4 min. Luego, las muestras se enfriaron y se recalentaron para solubilizar todos los triglicéridos en la solución. Después de la centrifugación para eliminar cualquier material insoluble, los sobrenadantes se diluyeron 1:10 con agua bidestilada. Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Se añadieron 50 µl de las respectivas muestras, estándar y 50 µl de muestra para control de fondo a una placa transparente de 96 pocillos. Luego se agregaron 2 µl de lipasa y tampón de ensayo para los pocillos estándar y de muestra, mientras que se agregaron 2 µl de tampón de ensayo TG al control de fondo de la muestra. Luego las reacciones se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con agitación constante. Posteriormente, se añadió la mezcla de reacción de triglicéridos a todos los pocillos de reacción, seguido de una incubación durante 60 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación constante. La producción se midió en un lector de microplacas a OD570.

Para la determinación de la actividad CYP, se realizaron las siguientes reacciones modelo; Etilmorfina-N-Desmetilación (EMND) indicativa de actividad CYP3A54, Etoxicumarina-O-Desetilación (ECOD) indicativa de actividad CYP1A, 2A, 2B y 2C55, Etoxiresorufin-O-Desetilación (EROD) indicativa de actividad CYP1A56, p-Nitrofenol-Hidroxilación (PNPH) indicativo de actividad CYP2E157, y pentoxiresorufina-O-despentilación (PROD) indicativo de actividad CYP2B56. Las muestras se homogeneizaron con tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4) (1:2 p/v). Posteriormente, las muestras de hígado homogeneizadas se centrifugaron a 9000 xg durante 20 minutos a 4 °C. Los 9000 g de sobrenadantes se utilizaron para evaluar las actividades de los CYP. El contenido de proteína se evaluó utilizando un método de Biuret modificado. La actividad de CYP se denominó contenido de proteína del sobrenadante de 9000 g. Para todas las reacciones modelo, la mezcla de reacción contenía 9000 g de sobrenadante, el sustrato, NADPH, MgCl2, glucosa-6-fosfato y tampón. La reacción se inició con la adición de NADPH y las muestras se incubaron a 37 °C durante 5 min (EROD), 10 min (ECOD, PROD, EMND) o 30 min (PNPH), respectivamente. Posteriormente, la reacción se detuvo con la adición de ácido tricloroacético enfriado con hielo (ECOD, PNPH y EMND) o metanol (EROD, PROD). Luego se centrifugaron las muestras y se midieron las concentraciones de los principales metabolitos en el sobrenadante. PNPH y EMND se cuantificaron fotométricamente (Spekol 1100, Carl Zeiss, Jena) midiendo los principales metabolitos 4-nitrocatecol o formaldehído, respectivamente. La reacción ECOD se evaluó fluorométricamente cuantificando la concentración del metabolito principal 7-hidroxicumarina. Para EROD y PROD, la concentración del metabolito principal resorufina también se determinó fluorimétricamente (RF-1502, Shimadzu, Kyoto, Japón), consulte la Tabla 3.

Los niveles del fármaco en términos de fármaco original y la concentración de sus metabolitos se midieron en sangre completa heparinizada, consulte la Tabla 4. El análisis se realizó utilizando tres métodos UPLC-MS/MS sensibles dedicados en un sistema Acquity UPLC conectado a Xevo TQ-XS o TQ- Detector S (Waters, Eschborn, Alemania). Los capilares de 9 µl se trituraron en total con un OMNI Bead Ruptor 24 (Bebensee, Alemania) usando una esfera cerámica recubierta de itrio y luego se fortalecieron con los correspondientes estándares internos deuterados: ad 12,5 ng/ml de midazolam-d4 y OH-Midazolam-d4. o 250 ng/ml de cafeína-d9 o codeína-d6, norcodeína-d3, codeína-6-glucurónido-d3, morfina-3-glucurónido-d3 y morfina-d6 (y 5,5 ng/ml de sangre entera cada uno). Después de la precipitación de proteínas y la extracción líquido/líquido, el sobrenadante diluido se inyectó en el sistema UPLC. Para cada fármaco de prueba, se utilizó un método cromatográfico específico. Se utilizó una columna Waters CSH C18 de 1,7 µm, 2,1 x 150 mm mantenida a 50 °C para midazolam/OH-Midazolam. La separación en gradiente se realizó en 6 min. Se utilizó un Waters BEH-Phenyl de 1,7 µm, 2,1 x 100 mm mantenido a 40 °C para la separación del gradiente de cafeína en 2,5 minutos. Se eligió una columna Waters HSS T3 de 1,8 µm, 2,1 × 150 mm para la separación en gradiente de codeína y metabolitos a 50 °C. El tiempo de ejecución cromatográfica fue de 9 min. El espectrómetro de masas se operó en modo ESI + y se monitorearon tres transiciones en SRM para cada analito y dos para los estándares internos. Los límites de cuantificación para la cafeína fueron 10 ng/ml y para todos los demás analitos al menos 1,0 ng/ml. Se realizó una calibración de matriz multipunto para cada analito. Todos los analitos están acreditados según la norma DIN EN ISO 15189. midazolam y OH-Midazolam y los opiáceos están acreditados además para fines forenses según DIN EN ISO 17025.

Para cada réplica, los cursos de tiempo de los componentes metabólicos después de la inyección en bolo se parametrizaron bajo el supuesto de que un aumento hasta un punto de inflexión máximo es seguido por una disminución exponencial. La función \(x\left(t\right)=t\cdot {e}^{B-At}\) con los parámetros A y B se utilizó para ajustar los datos experimentales. Se utilizó la caja de herramientas de Python lmfit58 para estimar estos parámetros para cada réplica por separado mediante la minimización de mínimos cuadrados. De cada curva ajustada, la concentración máxima \({x}_{peak}\), el momento de la concentración máxima \({t}_{peak}\), la vida media \({t}_{1/ 2}\) y se calculó el área bajo la curva (AUC), ver Fig. 10.

Los parámetros farmacocinéticos se calculan a partir de las curvas de caída exponencial, ajustadas a los datos experimentales. Se muestran datos ejemplares de la réplica 4 del control de codeína-6-glucurónido con parámetros ajustados A = 2,168 y B = 5,397. Los parámetros farmacocinéticos extraídos son la concentración máxima \({x}_{peak}\), el tiempo de la concentración máxima \({t}_{peak}\), la vida media \({t}_{1/2} \), y área bajo la curva desde el máximo (AUC).

El AUC solo se calculó para la fase de caída, es decir, la integral se calculó desde el punto de giro máximo hasta t = 6 h de la curva ajustada con scipy59. El tiempo pico \({t}_{peak}\) se calculó minimizando \(-x(t)\) con la correspondiente concentración máxima \({x}_{peak}=x({t}_{ cima})\). El tiempo de vida media \({t}_{1/2}\) se calculó como el tiempo necesario para que la concentración máxima se reduzca a la mitad. Para esto, la ecuación \(\frac{{x}_{peak}}{2}-t\cdot {e}^{B-At}=0\) se resolvió para \(t\), por lo que la mitad -el tiempo de vida da como resultado \({t}_{1/2}=t-{t}_{peak}\).

El modelo \(x\left(t\right)\) se interpretó como solución de una ecuación diferencial ordinaria (EDO) \(\dot{x}=(1-A\cdot t)\cdot {e}^{BA \cdot t}\) e implementado en el formato Systems Biology Markup Language (SBML)60,61. Se creó un problema de estimación de parámetros PEtab62 mediante yaml2sbml63. Se empleó la estimación de máxima verosimilitud para la estimación de parámetros. Suponiendo ruido aditivo independiente normalmente distribuido \(\sigma\), se lee la función de probabilidad \(L(\theta )\).

donde N es el número de réplicas en T diferentes momentos de medición, \(x\left({t}_{k},\theta \right)\) es la solución de la EDO y \({m}_{j }\left({t}_{k}\right)\) denota el valor de medición de la j-ésima réplica en el punto de tiempo \({t}_{k}\). El formato PEtab codifica esta función de probabilidad y se utilizó para una cuantificación de incertidumbre bayesiana. Para los parámetros A y B, se utilizó una distribución previa uniforme en el intervalo [0, 100]. Asimismo, el prior para \(\upsigma\) fue elegido uniformemente en el intervalo [0, 1000].

Los parámetros se muestrearon mediante el muestreo Markov Chain Monte Carlo (MCMC) utilizando el paquete de software pyPESTO64. Se utilizó el muestreador de templado paralelo adaptativo65 con cuatro cadenas y 200.000 muestras para evaluar la distribución posterior. Para investigar la convergencia de las cadenas MCMC y cortar las muestras quemadas, se aplicó la prueba de Geweke66. Las primeras 100 muestras se cortaron al menos incluso si la prueba de Geweke sugería un número menor para garantizar que solo se usaran muestras de la cadena convergente para el conjunto. La convergencia de las cadenas se comprobó visualmente y mediante el cálculo del Tamaño Efectivo de la Muestra (ESS). El ESS de todas las cadenas superó las 13.900 muestras; los resultados detallados se encuentran en FAIRDOMHub. Se creó un conjunto de parámetros a partir de la distribución posterior de parámetros con pyPESTO y se simuló mediante AMICI67. Estas simulaciones directas se utilizaron para calcular los intervalos de credibilidad de las distribuciones predictivas posteriores para los resultados del modelo. El modelo SBML, el archivo yaml que describe el problema de estimación de parámetros, la muestra completa del parámetro posterior, los parámetros estimados, los valores AUC, las vidas medias y una visualización de las trazas de muestreo se pueden encontrar en FAIRDOMHub [https://doi.org /10.15490/FAIRDOMHUB.1.STUDY.1070.1].

Se utilizó un ANOVA descriptivo ordinario unidireccional para detectar el impacto del protocolo de inducción dietética en los niveles de TG, la gravedad de la esteatosis (superficie relativa cubierta por gotitas de lípidos, respectivamente, por esteatosis macro y microvesicular), la actividad de CYP y la expresión inmunohistoquímica, y el AUC derivado. del análisis PK. La prueba de comparaciones múltiples de Tukey se realizó utilizando GraphPad Prism versión 9.3.1(471) para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU., www.graphpad.com. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en el caso de valores de p inferiores a 0,05.

Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson (r) con un intervalo de confianza del 95% y un valor de P de dos colas para evaluar la posible correlación lineal entre la gravedad de la esteatosis en términos de análisis de gotitas de lípidos y actividad de CYP. Además, la correlación lineal entre la esteatosis macrovesicular y microvesicular y el AUC se evaluó utilizando GraphPad Prism. Una correlación lineal (valor r) inferior a cero indica una correlación negativa, mientras que un valor r superior a cero indica una correlación positiva. La correlación se consideró fuerte en el caso de un valor de r ≥ 0,7, moderada en el caso de un valor de r entre 0,7 y 0,5, regular en el caso de un valor de r entre 0,5 y 0,3 e insignificante en el caso de un valor de r < 0,3, independientemente de que el coeficiente sea positivo o negativo68.

La matriz de correlación se calculó utilizando la correlación de Pearson. Los valores p se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini y Hochberg. El análisis se realizó con R versión 4.2.1 y el paquete corrplot.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas vigentes para el bienestar animal y las Directrices ARRIVE para informar sobre investigaciones con animales. El protocolo del experimento con animales fue aprobado por el comité de ética (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Alemania) (Número de aprobación: UKJ-19-020).

En este estudio se analizaron conjuntos de datos disponibles públicamente. Estos datos se pueden encontrar aquí en el repositorio FAIRDOMHub para compartir investigaciones sobre biología de sistemas69 (https://doi.org/10.15490/FAIRDOMHUB.1.STUDY.1070.1).

Garza, AZ, Park, SB & Kocz, R. Eliminación de fármacos. [Actualizado el 11 de julio de 2022]. En: StatPearls [Internet]. (Publicación StatPearls, 2022). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK547662/.

Almazroo, OA, Miah, MK & Venkataramanan, R. Metabolismo de fármacos en el hígado. Clínico. Enfermedad hepática. 21, 1. https://doi.org/10.1016/j.cld.2016.08.001 (2017).

Artículo de Google Scholar

Lindros, KO Zonación de la expresión del citocromo P450, metabolismo de fármacos y toxicidad en el hígado. General Farmacol. 28, 191-196. https://doi.org/10.1016/s0306-3623(96)00183-8 (1997).

Artículo CAS Google Scholar

Colnot, S. y Perret, C. En Patología molecular de las enfermedades hepáticas 7–16 (Springer, 2011).

Soto-Gutiérrez, A., Gough, A., Vernetti, LA, Taylor, DL y Monga, SP Investigaciones preclínicas y clínicas de la zonificación metabólica en enfermedades hepáticas: el potencial de los sistemas de microfisiología. Exp. Biol. Medicina. (Maywood) 242, 1605-1616. https://doi.org/10.1177/1535370217707731 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Kietzmann, T. Zonación metabólica del hígado: revisión del gradiente de oxígeno. Biol Redox. 11, 622–630. https://doi.org/10.1016/j.redox.2017.01.012 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Gebhardt, R. & Matz-Soja, M. Zonación hepática: aspectos novedosos de su regulación y su impacto en la homeostasis. Mundo J. Gastroenterol. 20, 8491–8504. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i26.8491 (2014).

Artículo de Google Scholar

Ghallab, A. y col. Influencia de la fibrosis hepática en la zonación lobulillar. Células https://doi.org/10.3390/cells8121556 (2019).

Artículo de Google Scholar

Weltman, MD, Farrell, GC y Liddle, C. Aumento de la expresión de CYP2E1 en hepatocitos en un modelo nutricional de rata de esteatosis hepática con inflamación. Gastroenterología 111, 1645-1653. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(96)70028-8 (1996).

Artículo CAS Google Scholar

Bell, LN y cols. La pérdida de peso inducida por la cirugía bariátrica reduce los niveles de peroxidación de lípidos hepáticos y afecta el contenido de proteína del citocromo P-450 hepático. Ana. Cirugía. 251, 1041–1048. https://doi.org/10.1097/SLA.0b013e3181dbb572 (2010).

Artículo de Google Scholar

Hata, S. y col. Citocromo 3A y 2E1 en tejido hepático humano: variaciones individuales entre sujetos japoneses normales. Ciencias de la vida. 86, 393–401. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2010.01.011 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Stärkel, P. y col. El estrés oxidativo, el KLF6 y la regulación positiva del factor de crecimiento transformante beta diferencian la esteatohepatitis no alcohólica que progresa a fibrosis de la esteatosis no complicada en ratas. J. Hepatol. 39, 538–546. https://doi.org/10.1016/s0168-8278(03)00360-x (2003).

Artículo de Google Scholar

Kostrzewski, T. y col. Modelo in vitro humano tridimensional perfundido de enfermedad del hígado graso no alcohólico. Mundo J. Gastroenterol. 23, 204–215. https://doi.org/10.3748/wjg.v23.i2.204 (2017).

Artículo de Google Scholar

Rey-Bedon, C. et al. Inducibilidad del fármaco CYP450 en NAFLD mediante un modelo hepático in vitro: comprensión de las interacciones entre fármacos en el hígado graso. Biomédica. Farmacóter. 146, 112377. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.112377 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Jiang, W., Guo, MH & Hai, X. Efectos hepatoprotectores y antioxidantes del licopeno sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico en ratas. Mundo J. Gastroenterol. 22, 10180–10188. https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i46.10180 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Weltman, MD, Farrell, GC, Hall, P., Ingelman-Sundberg, M. & Liddle, C. El citocromo hepático P450 2E1 aumenta en pacientes con esteatohepatitis no alcohólica. Hepatología 27, 128-133 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Fisher, CD y cols. Alteraciones de la enzima hepática citocromo P450 en humanos con etapas progresivas de enfermedad del hígado graso no alcohólico. Metab. de fármacos. Disposiciones. 37, 2087–2094. https://doi.org/10.1124/dmd.109.027466 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Cobbina, E. y Akhlaghi, F. Enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD): patogénesis, clasificación y efecto sobre las enzimas y los transportadores que metabolizan los fármacos. Metab. de fármacos. Apocalipsis 49, 197–211. https://doi.org/10.1080/03602532.2017.1293683 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Schenk, A. y col. Los modelos con base fisiológica en ratones sugieren una pérdida agravada de la capacidad de eliminación después de un daño hepático tóxico. Ciencia. Rep. 7, 6224. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04574-z (2017).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Seebacher, F., Zeigerer, A., Kory, N. y Krahmer, N. Homeostasis de las gotitas de lípidos hepáticos y enfermedad del hígado graso. Semín. Desarrollo celular. Biol. 108, 72–81. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2020.04.011 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Mashek, DG Gotitas de lípidos hepáticos: un acto de equilibrio entre el almacenamiento de energía y la disfunción metabólica en la NAFLD. Mol. Metab. https://doi.org/10.1016/j.molmet.2020.101115 (2020).

Artículo de Google Scholar

Brunt, EM Patología de la enfermedad del hígado graso. Modificación. Patol. 20 (Suplemento 1), S40-48. https://doi.org/10.1038/modpathol.3800680 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Schwen, LO et al. Cuantificación zonada de esteatosis en un hígado de ratón completo. Computadora. Biol. Medicina. 73, 108-118. https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2016.04.004 (2016).

Artículo de Google Scholar

Homeyer, A. y col. Las puntuaciones enfocadas permiten una discriminación confiable de pequeñas diferencias en la esteatosis. Diagnóstico. Patol. 13, 76. https://doi.org/10.1186/s13000-018-0753-5 (2018).

Artículo de Google Scholar

Gluchowski, NL, Becuwe, M., Walther, TC y Farese, RV Jr. Gotitas de lípidos y enfermedad hepática: desde la biología básica hasta las implicaciones clínicas. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 14, 343–355. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.32 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Sun, J. Inducción de hígado graso en ratas Lewis utilizando diferentes dietas Tesis de Doctorado en Medicina, Universidad de Duisburg-Essen (2011).

Zhong, F., Zhou, X., Xu, J. y Gao, L. Modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico. Digestión 101, 522–535. https://doi.org/10.1159/000501851 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Satapathy, SK, Kuwajima, V., Nadelson, J., Atiq, O. y Sanyal, AJ Enfermedad del hígado graso inducida por fármacos: una descripción general de la patogénesis y el tratamiento. Ana. Hepatol. 14, 789–806. https://doi.org/10.5604/16652681.1171749 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Miele, L. y col. Hígado graso y drogas: las dos caras de una misma moneda. EUR. Rev. Med. Farmacéutico. Ciencia. 21, 86–94 (2017).

CAS Google Académico

Fromenty, B. Inhibición de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales en la esteatosis hepática inducida por fármacos. Res. hepática. 3, 157-169 (2019).

Artículo de Google Scholar

Silva, GH, Hessel, G., Coelho, KIR & Escanhoela, CAF Esteatosis de causa indeterminada en un grupo pediátrico: ¿es una hepatopatía mitocondrial primaria?. Sao Paulo Med. J. 129, 217–223. https://doi.org/10.1590/S1516-31802011000400004 (2011).

Artículo de Google Scholar

Homeyer, A. y col. Identificación rápida y precisa de gotas de grasa en imágenes histológicas. Computadora. Métodos Progr. Biomédica. 121, 59–65. https://doi.org/10.1016/j.cmpb.2015.05.009 (2015).

Artículo de Google Scholar

Marsman, H. y col. Evaluación de la esteatosis hepática del donante: ¿patólogo o software automatizado?. Tararear. Patol. 35, 430–435. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2003.10.029 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Yersiz, H. et al. Evaluación de la esteatosis hepática por parte de un cirujano de trasplantes y un patólogo experto: una evaluación prospectiva, doble ciego, de 201 hígados de donantes. Trasplante de hígado. 19, 437–449. https://doi.org/10.1002/lt.23615 (2013).

Artículo de Google Scholar

Meihong, D. y col. Correlación limitada entre el patólogo convencional y la cuantificación automática asistida por computadora de la esteatosis hepática debido a la diferencia entre el análisis basado en eventos y el análisis basado en superficie. IEEE J. Biomed. Salud 18, 1473–1477. https://doi.org/10.1109/jbhi.2013.2282999 (2014).

Artículo de Google Scholar

Kleiner, DE et al. Diseño y validación de un sistema de puntuación histológica para la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Hepatología 41, 1313-1321. https://doi.org/10.1002/hep.20701 (2005).

Artículo de Google Scholar

Zhang, L. y col. La obesidad inducida por la dieta altera la expresión y función de las enzimas y transportadores hepáticos que metabolizan fármacos en ratas. Bioquímica. Farmacéutico. 164, 368–376. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2019.05.002 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Li, H. y col. Alteraciones de la actividad del citocromo P450 in vivo en ratones diabéticos con esteatohepatitis no alcohólica. J. Bioquímica. Mol. Toxico. 31, e21840. https://doi.org/10.1002/jbt.21840 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Jamwal, R. y col. Enfoque de cuantificación relativa múltiple y sin etiquetas para estudiar la abundancia de proteínas de las enzimas metabolizadoras de fármacos en microsomas hepáticos humanos utilizando SWATH-MS. J. Proteoma Res. 16, 4134–4143. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.7b00505 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Massart, J., Begriche, K., Hartman, JH y Fromenty, B. Papel del citocromo P450 2E1 mitocondrial en el hígado sano y enfermo. Células https://doi.org/10.3390/cells11020288 (2022).

Artículo de Google Scholar

Zhang, XB y cols. Disminución de la expresión del citocromo hepático P450 1A2 (CYP1A2) en un modelo de ratón con hipoxia crónica intermitente. J. Torác. Dis. 10, 825–834. https://doi.org/10.21037/jtd.2017.12.106 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Woolsey, SJ, Mansell, SE, Kim, RB, Tirona, RG y Beaton, MD Actividad y expresión de CYP3A en la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Metab. de fármacos. Disposiciones. 43, 1484-1490. https://doi.org/10.1124/dmd.115.065979 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Kolwankar, D. y col. Asociación entre esteatosis hepática no alcohólica y actividad del citocromo P-450 3A hepático. Clínico. Gastroenterol. Hepatol. 5, 388–393. https://doi.org/10.1016/j.cgh.2006.12.021 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Día, CP De la grasa a la inflamación. Gastroenterología 130, 207–210. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2005.11.017 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Baillie, TA y Rettie, AE Papel de la biotransformación en la toxicidad inducida por fármacos: influencia de las diferencias intra e interespecies en el metabolismo de los fármacos. Metab. de fármacos. Farmacéutico. 26, 15-29. https://doi.org/10.2133/dmpk.DMPK-10-RV-089 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

van Waterschoot, RA y cols. El metabolismo del midazolam en ratones knockout para el citocromo P450 3A se puede atribuir a la regulación positiva de las enzimas CYP2C. Mol. Farmacéutico. 73, 1029-1036. https://doi.org/10.1124/mol.107.043869 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Tachikawa, M. y col. Índice de zonación hepática del transportador de fármacos y expresiones de proteínas de enzimas metabolizadoras en acinos hepáticos de ratón. Metab. de fármacos. Disposiciones. 46, 610–618. https://doi.org/10.1124/dmd.117.079244 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Kulkarni, NM et al. Farmacocinética alterada de rosiglitazona en un modelo de ratón con enfermedad del hígado graso no alcohólico. Droga. Metab. Pers. El r. 31, 165-171. https://doi.org/10.1515/dmpt-2016-0008 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Lickteig, AJ y cols. La expresión del transportador de eflujo y la excreción del metabolito del paracetamol están alteradas en modelos de roedores con enfermedad del hígado graso no alcohólico. Metab. de fármacos. Disposiciones. 35, 1970–1978. https://doi.org/10.1124/dmd.107.015107 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Bang, WS, Hwang, YR, Li, Z., Lee, I. y Kang, HE Efectos del hígado graso no alcohólico inducido por ácido orótico sobre la farmacocinética del metoprolol y sus metabolitos en ratas. J. Farmacéutica. Farmacéutica. Ciencia. 22, 98-111. https://doi.org/10.18433/jpps30268 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Campos, G. et al. Supresión de redes de genes metabólicos asociada a la inflamación en la enfermedad hepática aguda y crónica. Arco. Toxico. 94, 205–217. https://doi.org/10.1007/s00204-019-02630-3 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Ramadori, G. & Christ, B. Citocinas y la respuesta hepática de fase aguda. Semín. Enfermedad hepática. 19, 141-155. https://doi.org/10.1055/s-2007-1007106 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Turner, PV, Brabb, T., Pekow, C. & Vasbinder, MA Administración de sustancias a animales de laboratorio: vías de administración y factores a considerar. Mermelada. Asociación. Laboratorio. Animación. Ciencia. 50, 600–613 (2011).

CAS Google Académico

Kleeberg, U. & Klinger, W. Determinación sensible de formaldehído con reactivo de Nash y reacción de triptófano. J. Farmacol. Método 8, 19–31. https://doi.org/10.1016/0160-5402(82)90004-3 (1982).

Artículo CAS Google Scholar

Aitio, A. Un ensayo simple y sensible de desetilación de 7-etoxicumarina. Anal. Bioquímica. 85, 488–491. https://doi.org/10.1016/0003-2697(78)90245-2 (1978).

Artículo CAS Google Scholar

Pohl, RJ & Fouts, JR Un método rápido para analizar el metabolismo de la 7-etoxiresorufina mediante fracciones subcelulares microsomales. Anal. Bioquímica. 107, 150-155. https://doi.org/10.1016/0003-2697(80)90505-9 (1980).

Artículo CAS Google Scholar

Chang, TK, Crespi, CL y Waxman, DJ Análisis espectrofotométrico de la hidroxilación de p-nitrofenol catalizada por CYP2E1 humano. Métodos Mol. Biol. 320, 127-131. https://doi.org/10.1385/1-59259-998-2:127 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Newville, M. y col. LMFIT: Minimización de mínimos cuadrados no lineal y ajuste de curvas para Python. Biblioteca de códigos fuente de astrofísica, ascl: 1606.1014 (2016).

Virtanen, P. y col. SciPy 1.0: Algoritmos fundamentales para la computación científica en Python. Nat. Métodos 17, 261–272. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0686-2 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Hucka, M. y col. El lenguaje de marcado de biología de sistemas (SBML): un medio para la representación e intercambio de modelos de redes bioquímicas. Bioinformática 19, 524–531. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btg015 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Keating, SM y cols. SBML Nivel 3: Un formato extensible para el intercambio y reutilización de modelos biológicos. Mol. Sistema. Biol. 16, e9110. https://doi.org/10.15252/msb.20199110 (2020).

Artículo de Google Scholar

Schmiester, L. y col. PEtab-Especificación interoperable de problemas de estimación de parámetros en biología de sistemas. Computación PLoS. Biol. 17, e1008646. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008646 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Vanhoefer, J., Matos, M., Pathirana, D., Schälte, Y. & Hasenauer, J. yaml2sbml: Especificación legible y escribible por humanos de modelos ODE y su conversión a SBML. J. Software de código abierto. 6, 3215. https://doi.org/10.21105/joss.03215 (2021).

ADS del artículo Google Scholar

Schälte, Y. et al. pyPESTO: caja de herramientas de estimación de parámetros para Python (0.2.7). https://doi.org/10.5281/zenodo.6606687 (2021).

Vousden, WD, Farr, WM y Mandel, I. Selección dinámica de temperatura para templado paralelo en simulaciones Monte Carlo de cadena de Markov. Lun. No. R. Astron. Soc. 455, 1919-1937. https://doi.org/10.1093/mnras/stv2422 (2016).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Geweke, JF Evaluación de la precisión de los enfoques basados ​​en muestreo para el cálculo de momentos posteriores. Informe No. Staff Report 148, (Banco de la Reserva Federal de Minneapolis, 1991).

Fröhlich, F. et al. AMICI: Análisis de sensibilidad de alto rendimiento para grandes modelos de ecuaciones diferenciales ordinarias. Bioinformática 37, 3676–3677 (2021).

Artículo de Google Scholar

Mukaka, MM Statistics Corner: Una guía para el uso apropiado del coeficiente de correlación en la investigación médica. Malawi Med. J. 24, 69–71 (2012).

CAS Google Académico

Wolstencroft, K. y col. FAIRDOMHub: un entorno de repositorio y colaboración para compartir investigaciones en biología de sistemas. Ácidos nucleicos res. 45, D404–D407. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1032 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

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Nos gustaría agradecer a Ana Paz, Isabel Jank, Haotian Chen y Sadaf Khalatbarizamanpoor por su excelente apoyo técnico durante el experimento.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Esta investigación fue financiada por la Fundación Alemana de Investigación (DFG), “SteaPKMod, subvención número 410848700” y “FOR 5151 QuaLiPerF, subvención número 436883643” y “SimLivA, subvención número 465194077”. MK contó con el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, Alemania) dentro de la red de investigación Medicina de Sistemas del Hígado (LiSyM, número de subvención 031L0054).

Cirugía Experimental de Trasplantes, Departamento de Cirugía General, Visceral y Vascular, Hospital Universitario de Jena, Jena, Alemania

Mohamed Albadry, Nadia Ehteshamzad y Uta Dahmen

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Menoufia, Shebin Elkom, Menoufia, Egipto

Mohamed Albadry

Instituto de Teoría de Sistemas y Control Automático, Facultad de Diseño Técnico, Ingeniería de Producción e Ingeniería Automotriz, Universidad de Stuttgart, Stuttgart, Alemania

Sebastian Höpfl y Nicole Radde

Instituto de Biología Teórica, Instituto de Biología, Universidad Humboldt, Berlín, Alemania

Matías König

MVZ Medizinische Labore Dessau Kassel GmbH, Bauhüttenstraße 6, 06847, Dessau-Roßlau, Alemania

Michael Böttcher y Jasna Neumann

Instituto de Farmacología y Toxicología, Hospital Universitario de Jena, Jena, Alemania

Amelie Lupp

Instituto de Patología, Klinikum Chemnitz, Chemnitz, Alemania

Olaf Dirsch

Laboratorio de Trasplante Celular/Hepatología Molecular, Departamento de Cirugía Visceral, Trasplante, Torácica y Vascular, Centro Médico de la Universidad de Leipzig, Leipzig, Alemania

Bruno Cristo y Madlen Cristo

Fraunhofer MEVIS, Max-Von-Laue-Str. 2, 28359, Bremen, Alemania

Lars Ole Schwen y Hendrik Laue

Instituto de Patología Veterinaria, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Robert Klopfleisch

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Conceptualización, UD, OS, OD, MA, HL; metodología: UD, OD, MA, SH, AL, BC, MC; software, NS; validación: MB, MA; análisis formal, MA, SH, HL, MK; investigación, MA, NE, MB, AL, BC, MC; recursos, UD, MB, BC, AL; curación de datos; HL, redacción: preparación del borrador original, MA, SH, MB, AL, UD; redacción, revisión y edición, todos los autores; visualización, MA, SH; supervisión, UD, OS; administración de proyectos, UD, OS; adquisición de financiación, UD, OS, NR Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Uta Dahmen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Albadry, M., Höpfl, S., Ehteshamzad, N. et al. La esteatosis periportal en ratones afecta distintos parámetros del metabolismo pericentral de los fármacos. Representante científico 12, 21825 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26483-6

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Recibido: 14 de septiembre de 2022

Aceptado: 15 de diciembre de 2022

Publicado: 17 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26483-6

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