El ADN mitocondrial es un objetivo de la integración del VHB

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 684 (2023) Citar este artículo

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El virus de la hepatitis B (VHB) puede integrarse en el genoma de las células infectadas y contribuir a la hepatocarcinogénesis. Sin embargo, el papel de la integración del VHB en el desarrollo del carcinoma hepatocelular (CHC) aún no está claro. En este estudio, aplicamos un enfoque de secuenciación de integración del VHB de alto rendimiento que permite la identificación sensible de los sitios de integración del VHB y la enumeración de clones de integración. Identificamos 3339 sitios de integración del VHB en muestras pareadas de tejido tumoral y no tumoral de 7 pacientes con CHC. Detectamos 2107 integraciones expandidas clonalmente (1817 en tumores y 290 en tejidos no tumorales) y un enriquecimiento significativo de integraciones clonales del VHB en el ADN mitocondrial (ADNmt) que se producen preferentemente en los genes de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la región del bucle D. También encontramos que las secuencias de ARN del VHB se importan a las mitocondrias de las células de hepatoma con la participación de la polinucleótido fosforilasa (PNPASE), y que el ARN del VHB podría tener un papel en el proceso de integración del VHB en el ADNmt. Nuestros resultados sugieren un mecanismo potencial mediante el cual la integración del VHB puede contribuir al desarrollo del CHC.

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para el desarrollo del carcinoma hepatocelular (CHC). En comparación con las personas sanas, los pacientes con hepatitis B crónica (HBC) tienen un riesgo hasta 100 veces mayor de desarrollar CHC, que es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, con ~780 000 muertes al año1,2. Se ha detectado ADN viral integrado en 85 a 90 % de los CHC relacionados con el VHB, y su presencia en tumores que se desarrollan en hígados no cirróticos de niños o adultos jóvenes respalda aún más el papel de la integración del ADN viral en la hepatocarcinogénesis3,4,5. 6,7. La integración del ADN del VHB en el genoma del huésped puede provocar inestabilidad cromosómica, mutagénesis de inserción, desregulación de la expresión del gen del huésped y producción de proteínas virales mutantes, como proteínas de superficie truncada y HBx con propiedades oncogénicas conocidas8,9. Aunque los sitios de inserción del ADN del VHB parecen estar distribuidos aleatoriamente en todo el genoma del huésped, el uso reciente de métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) ha llevado a la identificación del enriquecimiento de la integración del VHB en genes específicos que provocan cáncer, incluidos TERT, MLL4, CCNE1 y CCNA2, en tejidos tumorales7,10,11,12,13,14,15,16. Además, un estudio reciente ha demostrado que las alteraciones recurrentes del número de copias en los genes causantes del cáncer pueden estar asociadas con la integración viral a distancia16. Aunque se ha estudiado un número significativo de casos, los genes conocidos relacionados con el cáncer se alteran por la integración del VHB sólo en una pequeña proporción de los CHC relacionados con el VHB. Numerosos estudios también han demostrado que elementos genómicos específicos, como secuencias repetitivas, secuencias de ADN para ARN no codificantes y retrotransposones, son el objetivo de la integración del VHB7,11,12,14,17,18,19. Un estudio realizado en Hong Kong que analizó líneas celulares de CHC positivas para VHB mostró que la expresión de un transcrito quimérico HBx-LINE1 específico tiene una función promotora de tumores, y una gran proporción de los CHC evaluados expresan este transcrito17. No obstante, la expresión de HBx-LINE1 no se confirmó en una gran serie de CHC relacionados con el VHB de pacientes europeos20.

A pesar de los avances en la investigación sobre la integración del ADN del VHB, muchos aspectos clave siguen sin estar claros. En general, el desarrollo de métodos de detección alternativos para la integración del VHB puede ayudar a comprender mejor los mecanismos implicados en el proceso cancerígeno inducido por la integración del VHB.

Al aplicar un método de secuenciación de integración del VHB de alto rendimiento (HBIS), en este estudio detectamos el enriquecimiento de la integración del virus en el ADN mitocondrial (ADNmt) de tejidos hepáticos tumorales y no tumorales de pacientes con CHC. Además, aplicamos HBIS y RNASeq a mitocondrias purificadas a partir de células HepAD38 inducidas por VHB y detectamos múltiples integraciones de VHB en ADNmt, así como transcripciones de fusión mitocondrial-VHB. Todas las integraciones mitocondriales en tejidos tumorales se expandieron clonalmente e involucraron tanto a los genes mitocondriales de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) como a la región del bucle D. También encontramos que las secuencias de ARN del VHB se importan a las mitocondrias de las células de hepatoma y que la polinucleótido fosforilasa (PNPASE) podría estar involucrada en la importación de transcripciones virales.

Se construyeron un total de 297 bibliotecas de integración a partir del tejido tumoral de siete pacientes con CHC relacionado con el VHB y tejido hepático no tumoral adyacente emparejado que estaba disponible para seis de los siete pacientes (Tabla 1). Las bibliotecas se generaron utilizando una modificación del método de secuenciación de integración desarrollado por Cohn et al. estudiar el perfil de integración del VIH-1 en células T CD4+21. Nos referimos al método utilizado en este artículo como secuenciación de integración del VHB de alto rendimiento (HBIS) (Fig. 1).

Al aplicar HBIS, los sitios de integración del VHB se recuperaron mediante PCR mediada por ligadura semi-anidada a partir del ADN del huésped (fragmentado por sonicación, con cola A y ligado a conectores de ADN asimétricos) y el uso de cebadores directos o inversos específicos de diferentes genes genómicos del VHB. regiones. Las secuencias objetivo se enriquecieron aún más realizando una PCR anidada con cebadores MiSeq HBV directos o inversos y pLinkers MiSeq directos o inversos, todos con un adaptador Illumina para el recocido de la superficie de las células de flujo. Los fragmentos ligados al adaptador se enriquecieron mediante PCR con cebadores Illumina Índice 1 e Índice 2, y los productos de la PCR se sometieron a secuenciación de extremos emparejados de alto rendimiento. Las lecturas se alinearon con un genoma híbrido que incluye los genomas de referencia humanos GRCh38.p10 (acceso a GenBank: GCA_000001405.25) y VHB (acceso a GenBank: NC_003977).

Se detectaron un total de 3339 sitios de integración del VHB en los 7 pacientes estudiados (Datos complementarios 1): 2913 integraciones en muestras de tejido tumoral y 426 en muestras de tejido no tumoral. El número promedio de sitios de integración en tejidos tumorales y no tumorales adyacentes fue de 416 ± 387 y 71 ± 56 (P = 0,054, prueba t de Student), respectivamente. Todos los pacientes estudiados mostraron integración del VHB, con un promedio de 257 integraciones por paciente. Además, se detectaron sitios de integración del VHB en todas las muestras de tejido tumoral y no tumoral examinadas, y cada sitio estaba respaldado por al menos tres lecturas de extremos emparejados.

Como se demostró en estudios previos21,22,23, al acoplar la fragmentación aleatoria del ADN (que genera sitios de ligamiento de conectores únicos) con la secuenciación de extremos emparejados (que permite la identificación precisa tanto del sitio de integración como del extremo fragmentado), es posible identificar integraciones expandidas clonalmente ( sitios de integración idénticos con extremos de fragmentación distintos, derivados de la expansión clonal de un único evento de integración) e integraciones únicas (sitios de integración únicos con un único extremo fragmentado). Por lo tanto, el método HBIS que permite la enumeración de sitios de integración virales idénticos permite la identificación de integraciones expandidas clonalmente. Estimamos que 2107 (63%) de los 3339 sitios de integración del VHB detectados eran integraciones expandidas clonalmente. Entre las 2.107 integraciones clonales, 1.817 (86,2%) se encontraron en tejidos tumorales y 290 (13,8%) en tejidos no tumorales. Sin embargo, la proporción de puntos de ruptura de integración expandidos clonalmente fue significativamente mayor en tejidos no tumorales [290/426 (68%) versus 1817/2913 (62,4%); P = 0,025, prueba Z] que en muestras de tejido tumoral cuando se tuvo en cuenta el número total de integraciones. Aunque el tamaño de los clones individuales varió de 3 a 3253 en tumores y de 3 a 376 en muestras de tejido no tumoral, el tamaño medio de los clones de los primeros fue similar al de los clones de los segundos (14,8 ± 125,3 versus 18,3 ± 35 ; P = 0,589, prueba t de Student). Por lo tanto, los tumores evaluados exhibieron una proporción significativamente mayor de clones pequeños [tamaño de clon ≤100: 1795/1817 (98,8%) versus 281/290 (96,8%); P = 0,008, prueba Z] y un número significativamente mayor de sitios de integración únicos [1096/2913 (37,6%) versus 136/426 (31,9%); P = 0,022] que los tejidos no tumorales. Estos resultados contrastan con hallazgos reportados previamente16, lo que puede deberse al número limitado de tumores estudiados y al hecho de que todos los tumores analizados estaban (a) histológicamente bien diferenciados (Edmondson-Steiner grado I-II, ES GI- GII)24, (b) mostró niveles de replicación del VHB comparables a los detectados en muestras de tejido no tumoral compatibles (Tabla 2), y (c) expresó el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP), el receptor de entrada del VHB, aunque en niveles más bajos. que los tejidos no tumorales (P = 0,028, prueba t de Student) (Fig. 2). Por lo tanto, al mantener la capacidad de apoyar la replicación y reinfección del virus, las células tumorales bien diferenciadas pueden ser propensas a la aparición de nuevos eventos de integración del VHB con el tiempo.

La expresión del gen NTCP se evaluó en seis tejidos hepáticos no tumorales y siete tejidos tumorales mediante qRT-PCR. NTCP se expresó en todos los tumores analizados, aunque en niveles más bajos que en los tejidos no tumorales. Los resultados se expresan como cambios en relación con los niveles de expresión de NTCP en tejidos no tumorales y se normalizan con respecto a la expresión de GAPDH. Las mediciones se realizaron por duplicado y los resultados son el promedio de tres experimentos independientes (n = 3). Las barras de error representan la media ± DE. Prueba t de Student no apareada, P = 0,028.

Los sitios de integración del VHB detectados se distribuyeron aleatoriamente en todo el genoma y la simulación de Monte Carlo no reveló ningún punto crítico25. Sin embargo, el análisis de la distribución de los puntos de ruptura del VHB en los cromosomas individuales (después de la normalización del número de integraciones a la longitud de cada cromosoma) mostró un enriquecimiento estadísticamente significativo de los sitios de integración en la región centromérica del cromosoma 20 en muestras de tumores (P = 0,018, NPC prueba) (Datos complementarios 2), mientras que las muestras no tumorales exhibieron una distribución relativamente aleatoria de los sitios de integración entre los cromosomas. Para evaluar si la posición de las integraciones del VHB en el genoma del huésped está asociada con la expansión clonal, realizamos una comparación entre la ubicación genómica de las integraciones del VHB expandidas clonalmente y únicas en tejidos tumorales y no tumorales. Descubrimos que tanto las integraciones clonales como las individuales mostraron una distribución comparable en genes y regiones intergénicas de las muestras de tejido tumoral y no tumoral.

Como las integraciones clonales se han asociado con genes involucrados en la transformación maligna, examinamos nuestro conjunto de datos para determinar el enriquecimiento de las integraciones en genes asociados con HCC. Los genes expandidos clonalmente a los que se dirige la integración del VHB de nuestro estudio se compararon con los informados recientemente en la base de datos de sitios de integración viral (VISDB, disponible en https://bioinfo.uth.edu/VISDB), la colección más completa de sitios de integración viral ( VIS) para virus de ADN (incluido el VHB) y retrovirus de ARN26. De los 5573 genes dirigidos al VHB en el CHC informados en VISDB, 381 se detectaron en muestras de tejido de los 7 pacientes estudiados (323 en muestras de tejido tumoral y 58 en muestras de tejido no tumoral). Entre los 381 genes dirigidos al VHB, 35 (AOAH, ANKS1B, CAMTA1, CDH4, CYP2E1, DSCAML1, EXOC4, FCHSD2, FSTL4, VIHEP3, HSPA12A, IGH, IQSEC1, JARID2, KCNQ3, LMF1, MED26, MLPH, MPG, NFAT5, NCOR2, PLD5, PTPRG, PTPRM, TRAPPC9, SLC29A3, SDCCAG8, SMOC1, SYNGR1, TGFBRAP1, WDR66, WNK2, ZHX2, ZMIZ1, ZNF536) se vieron afectados recurrentemente (en 2 o más muestras) en tejidos tumorales y 1 (NRG3) en no -tejidos tumorales. Se observaron eventos de integración que ocurrieron en muestras individuales en los siguientes genes causantes del cáncer: TERT, KMT2B (MLL4), RIMS1, FN1, RBFOX1, CNTNAP2 y THRB7,11,12,14,27,28. Además, encontramos otros siete genes afectados recurrentemente por la integración del VHB en muestras de tejido tumoral: ECE1, EVI5L, KIF13B, MTX1P1, PLXND1, TECR y USP24.

También se anotaron los sitios de integración del VHB para analizar su distribución en distintos elementos genómicos. Las integraciones fueron más frecuentes en repeticiones simples en muestras no tumorales que en muestras tumorales [60/290 (20,7%) versus 88/1817 (4,8%); P <0,001, prueba Z], mientras que se observó un enriquecimiento estadísticamente significativo de las integraciones para secuencias repetitivas en muestras tumorales en comparación con muestras no tumorales [1376/1817 (75,7%) versus 179/290 (61,7%); P <0,001, prueba Ζ]. Los tejidos tumorales también mostraron un número significativamente mayor de integraciones en elementos nucleares cortos intercalados (SINE, 310/1817 (17%) versus 26/290 (8,9%); P <0,001] y retrotransposones de repeticiones terminales largas (LTR) [264/1817 (14,5%) frente a 28/290 (9,6%); P = 0,024]. También se produjo un gran número de integraciones del VHB en elementos nucleares intercalados largos (LINE) [250/1817 (13,7%) frente a 40/290 (13,7%) ; P = 0,999], aunque no se observaron diferencias significativas entre las muestras de tejido tumoral y no tumoral (Figura 1 complementaria). Curiosamente, se encontró enriquecimiento de los integrantes del VHB, incluida la región genómica X, en las secuencias LINE de tejidos tumorales [ 195/1817 (10,7%) versus 19/290 (6,5%); P = 0,027], mientras que los integrantes virales, incluidas las secuencias genómicas S, fueron significativamente más frecuentes en LINE (52/1817 (2,9%) versus 22/290 (7,6 %); P < 0,001) de muestras de tejido no tumoral.

La caracterización de los puntos de interrupción en el genoma del VHB (Figura 2 complementaria) reveló una acumulación de puntos de interrupción de integración en los nucleótidos 1500-2000, incluido el extremo 3' del HBx y el extremo 5' de los genes Precore/Core, en muestras de tejido tumoral [ 855/1817 (47,1%) versus 75/290 (39,5%), P <0,0001] en comparación con tejidos no tumorales. En los tejidos tumorales, también se encontró una mayor proporción de sitios de integración en los nucleótidos 1000-1200, incluido el promotor ENH I/X [340/1817 (18,7%) versus 20/290 (6,9%), P <0,0001]. En muestras de tejido no tumoral, los puntos de corte del VHB se enriquecieron significativamente en los nucleótidos 400 a 750 del gen S [460/1817 (25,3%) versus 147/290 (50,7%), P <0,0001]. Además, la secuencia inmunodominante "determinante" del gen S se incluyó en una proporción significativamente mayor de secuencias quiméricas de muestras no tumorales [73/290 (25%) versus 75/1817 (4%); p<0,0001].

Para dilucidar el mecanismo de integración del VHB, se investigó la presencia de secuencias de microhomología (MH) entre el ADN nuclear y los integrantes del ADN del VHB a nivel de los sitios de integración. Descubrimos que la mayoría de los 3339 sitios de integración del VHB en nuestros casos mostraron la presencia de secuencias de MH en muestras tanto tumorales como no tumorales (Tabla complementaria 1 y Datos complementarios 1). La presencia de enriquecimiento de la secuencia de MH en el sitio de unión entre el VHB integrado y el ADN celular indica que el mecanismo de reparación del ADN de unión final mediado por MH (MMEJ) puede promover la inserción viral a nivel de roturas genómicas.

Nuestro análisis de la distribución del punto de ruptura del VHB nos llevó a identificar el ADN mitocondrial (ADNmt) como un objetivo de integración del VHB. De hecho, en comparación con el número de integraciones en cromosomas individuales, se observó un enriquecimiento estadísticamente significativo de los sitios de integración del virus en el ADNmt (P <0,0001, prueba NPC), tanto en muestras tumorales (P <0,0001) como no tumorales (P < 0,0001), después de la normalización del número de integraciones a la longitud del ADNmt (considerando una cantidad mediana de 2000 copias de ADNmt por hepatocito29) (Datos complementarios 2). Encontramos 20 integraciones del VHB en el ADNmt (que varían en longitud entre 49 pb y 187 pb) a partir de muestras de tejido obtenidas de 4 (0501, 0504, 0505 y 0506) de los siete pacientes estudiados (Fig. 3, Tabla 3 y Datos complementarios 3) . En particular, observamos una correlación entre la integración del VHB en el ADNmt y niveles más altos de ADN del VHB en suero (rS = 0,899, P = 0,006; prueba de correlación de Spearman), así como cantidades intrahepáticas más altas de ADN del VHB (rS = 0,866, P = 0,012) y pgRNA (rS = 0,878, P = 0,021) en estos pacientes. Entre los 20 sitios de integración del VHB, 17 se detectaron en ADNmt de tejidos tumorales y 3 se encontraron en ADNmt de muestras de tejido no tumoral (Tabla 3 y Datos complementarios 3). Todos los puntos de ruptura de integración detectados en mitocondrias de tejidos tumorales y no tumorales fueron integraciones expandidas clonalmente. Los sitios de integración del VHB en el ADNmt de tejidos tumorales, en comparación con los de tejidos no tumorales (11/17 versus 0/3; P = 0,073, prueba exacta de Fisher), se ubicaron preferentemente dentro de genes mitocondriales relacionados con el sistema OXPHOS, que es el vía bioquímica final para la producción de ATP y está compuesta por cinco complejos enzimáticos multiproteicos (I-V) y dos transportadores de electrones (coenzima Q y citocromo c)30. En particular, se detectaron integraciones del VHB en muestras de tejido tumoral en genes mitocondriales que codifican las subunidades centrales ND1, ND2, ND4 y ND5 del Complejo OXPHOS I, CYTB del Complejo OXPHOS III, COX1 del Complejo OXPHOS IV y ATP6 del Complejo OXPHOS V. El gen mitocondrial RNR2 (16 S rRNA) y la región mitocondrial del bucle de desplazamiento regulador no codificante (bucle D) también fueron objetivos del VHB en tejidos tumorales. Por el contrario, las integraciones del VHB en el ADNmt de muestras de tejido no tumoral solo se encontraron dentro de la región del bucle D (3/17 versus 3/3; P = 0,017). El paciente 0504 mostró el mayor número de integraciones virales en el ADNmt, con 12 sitios de integración diferentes en la muestra del tumor (3 en RNR2, 2 en ND4, 2 en ND5, 1 en ND1, 1 en ATP6, 1 en CYTB y 2 en el Región del bucle D) y 1 en la muestra de tejido no tumoral (en la región del bucle D) (Fig. 3, Tabla 3 y Datos complementarios 3). La integración del VHB en la región del bucle D (Figuras complementarias 3a, b), así como en los genes RNR2, CYTB (Figuras complementarias 4a, b) y ND5 (Figuras complementarias 5), en este paciente se confirmó mediante Secuenciación de Sanger. En cuanto al gen ND5, la clonación y la secuenciación de Sanger nos llevaron a identificar la secuencia completa del VHB integrada en este gen (Figura complementaria 5). La longitud del fragmento viral integrado fue de 363 pb e incluyó dos elementos del sitio de activación del interferón gamma (GAS) y la región ENHI del VHB.

Los genes del VHB están representados en negro (Polymerase, Pol), verde (Precore/Core, C), diferentes gradientes de azul (preS/S) y naranja (X). Los genes mitocondriales están representados en verde azulado, verde brillante y rojo. La región reguladora del bucle D mitocondrial está representada en gris. Las uniones VHB-mitocondrias en los tejidos tumorales están representadas por líneas rojas. Las uniones VHB-mitocondrias en tejidos no tumorales están representadas por líneas azules.

El análisis de los puntos de corte del genoma del VHB mostró un enriquecimiento no tumoral de los sitios de integración en los nucleótidos 2877–752 (incluida la región preS/S) dentro de la región del bucle D y una mayor proporción de puntos de corte en los nucleótidos 1000–1887 (incluido el ENH I/ promotor X, el gen X, ENH II/BCP y la región Precore) dentro de genes mitocondriales que codifican proteínas (Fig. 3) en tejidos tumorales. La presencia de microhomología (MH) que oscila entre 1 pb y 18 pb entre el VHB integrado y el ADNmt en el sitio de la unión virus-mitocondrial se observó en 19 de las 20 uniones de integración (Datos complementarios 3), lo que sugiere que MMEJ también puede desempeñar un papel importante. papel importante en el proceso de integración del VHB en el ADNmt.

Para verificar el efecto de dicha integración viral en la expresión de genes mitocondriales, realizamos un análisis de RNASeq, aunque solo se obtuvo ARN de alta calidad (Número de integridad de ARN ≥8) para realizar este análisis del paciente 0504. Entre las transcripciones quiméricas detectadas en el tejido tumoral , identificamos secuencias de fusión que contienen parte de los genes mitocondriales RNR2 y ND4, que tenían sitios de integración correspondientes en el ADNmt (Datos complementarios 3).

Se sabe que el ADNmt puede ingresar al núcleo e integrarse en el genoma nuclear en las roturas de doble cadena (DSB) del ADN, dando lugar a copias nucleares de secuencias de ADNmt (numts)31. Por lo tanto, no podemos excluir que los integrantes del VHB detectados por HBIS en las mitocondrias de los pacientes puedan estar ubicados dentro de numts. En un intento por aclarar esto, llevamos a cabo una investigación más profunda de la integración del VHB en la línea celular HepAD38, que admite la replicación del VHB inducible sin tetraciclina (Tet)32. Tras la eliminación de Tet del medio de cultivo, estas células producen ARN virales, acumulan partículas subvirales en el citoplasma, que contienen intermediarios de ADN característicos de la replicación viral, y secretan partículas similares a virus32 que contienen ADN o ARN del VHB en el sobrenadante33. Investigamos la integración del VHB en células HepAD38 (tanto por HBIS como por RNASeq) después de la eliminación de Tet durante 7 días. En este momento, las cantidades medias de ADN y ARN del VHB en células HepAD38 fueron 1,1 × 103 ± 6,0 × 102 y 1,0 × 10 ± 5,9 × 10−1 copias/célula, respectivamente; mientras que las cantidades medias de ADN del VHB y HBsAg en los sobrenadantes de células fueron 2 × 106 ± 2,7 × 104 copias/mL y 4,1 × 103 ± 7,2 × 102 UI/mL, respectivamente. Por lo tanto, en este momento, aplicamos HBIS para investigar la presencia de sitios de integración del VHB tanto en el ADN extraído de núcleos purificados como en el ADN obtenido de mitocondrias purificadas de células HepaD38 productoras de VHB, mientras que aplicamos RNASeq para analizar la presencia de transcripciones híbridas. en núcleos purificados más citoplasma y en mitocondrias aisladas de las mismas células. Según HBIS, no se detectó integración viral en numts potenciales presentes en el ADN nuclear de células HepAD38 productoras de VHB, mientras que sí detectamos sitios de integración del VHB en los genes COX1, RNR2 y ND2 en el ADN obtenido de mitocondrias purificadas (Datos complementarios 4). De manera análoga, RNASeq no reveló integración viral en extractos de ARN nuclear/citoplasmático de células HepAD38 productoras de VHB, pero se identificaron varias secuencias quiméricas de mitocondrias de VHB que contienen parte de las secuencias COX1, COX3, ND4 y ND6 en el ARN aislado de mitocondrias de VHB-. produciendo células HepAD38 (Datos complementarios 4 y Figura complementaria 6).

Las muestras de tejido hepático para análisis adicionales solo estuvieron disponibles de tres (0501, 0504 y 0505) de los cuatro pacientes que albergaban integración del VHB en el ADNmt. Por lo tanto, para investigar más a fondo la integración del VHB en el ADNmt, se analizó la presencia del genoma del VHB libre y las transcripciones del VHB en mitocondrias y núcleos de muestras de tejido tumoral de los pacientes 0501, 0504 y 0505 y de muestras de tejido hepático de cinco pacientes con HBeAg negativo crónico. hepatitis B (HBC) con replicación viral activa (nivel medio de ADN del VHB en suero: 5,6 × 107 ± 3,06 × 107 UI/mL) (Fig. 4a, c). Se utilizaron como controles negativos mitocondrias y núcleos de muestras de tejido hepático de ocho pacientes VHB negativos y de células HepG2 (Fig. 4b, d). No se detectó ni el genoma completo del VHB ni el ADNcc del VHB en las mitocondrias de ninguna de las muestras de tejido hepático analizadas ni de las células HepG2 (Fig. 4a, b). Sin embargo, el análisis de las transcripciones del VHB reveló la presencia de secuencias de ARN del VHB correspondientes a las regiones genómicas PreS1, S, Epsilon y X en las mitocondrias de todas las muestras de tejido hepático positivo para el VHB, pero no en las mitocondrias de los tejidos hepáticos negativos para el VHB ni en las células HepG2. Figura 4e). Se sabe que las mitocondrias importan una amplia variedad de ARN codificados en el núcleo34,35,36,37,38. La importación de la mayoría de estos ARN en células de mamíferos está regulada por la PNPASE, que también posee actividades de exoribonucleasa 3' → 5' y poli-A polimerasa y se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial (IMS)35,36,39. Teniendo en cuenta que la PNPASE transloca a las mitocondrias varios ARN que contienen una señal de importación distinta, es decir, una pequeña estructura de tallo-bucle, intentamos determinar si una secuencia (y estructura) de importación similar está presente en las transcripciones del VHB. En particular, se identificó una secuencia de señal de importación casi idéntica en la región preS1 (nt 3049–3065) (Fig. 5a). Además, nos preguntamos si las estructuras de bucle de tallo de las transcripciones del VHB en el extremo 5' y cerca del extremo 3', como "épsilon" y PRE [elemento regulador postranscripcional, que incluye el bucle de tallo α (SLα, nucleótidos 1292) –1321) y SLβ (nucleótidos 1411-1433)]40, funcionan como secuencias de importación mitocondriales. Después de determinar que las células HepG2 produjeron PNPASE (Fig. 5b), verificamos si los ARN del VHB también se localizan en las mitocondrias mediante la realización de un ensayo de importación in vitro utilizando una secuencia sintetizada marcada con biotina de la transcripción PreS1 (nt 2850–837, incluido el supuesta señal de importación PreS1), de la transcripción de la polimerasa (nt 670–1350, incluido SLα), del pgRNA (nt 1781–2068, incluido épsilon) y de la transcripción X (nt 1376–1840, incluido SLβ). Se aislaron secuencias de ARN y mitoplastos de células HepG2. Antes del aislamiento del ARN y la RT-PCR, se realizó un tratamiento con nucleasa para eliminar el ARN no importado. Todas las secuencias de ARN del VHB marcadas con biotina se importaron a las mitocondrias, pero no el ARNm de COX3 que se utilizó como control (Fig. 5c, d). Estos resultados nos llevaron a verificar si PNPASE puede ayudar a importar ARN del VHB. Por tanto, investigamos si los ARN del VHB se unen directamente a la PNPASE. Las mitocondrias aisladas de células HepG2, después del tratamiento con digitonina y nucleasa, se incubaron con ARN del VHB marcados con biotina sintetizados in vitro. Las secuencias de ARN viral biotinilado se eliminaron utilizando perlas recubiertas de estreptavidina y la PNPASE de unión a ARN se detectó mediante análisis de transferencia Western (Fig. 6). Es importante destacar que PNPASE, pero no HSP90 (utilizada como control), se une a las secuencias de ARN transcritas in vitro que contienen la supuesta señal de importación PreS1 (nt 2850–837), SLα (nt 670–1350), épsilon (nt 1781–2068) y SLβ (nt 1376-1840) (Fig. 6a, b). Además, las secuencias de ARN del VHB se unieron específicamente a PNPASE, aunque la secuencia de ARN de COX3 no lo hizo (Fig. 6a, b). Estos resultados implican la especificidad estructural de la importación de ARN viral mitocondrial y la participación directa de la PNPASE en este proceso.

Se analizaron el genoma completo del VHB, el ADNccc del VHB y el ARN del VHB en mitocondrias en mitoplastos tratados con nucleasas y en núcleos aislados de muestras de tejido tumoral obtenidas de los pacientes 0501, 0504 y 0505 y de muestras de tejido hepático obtenidas de 5 pacientes con hepatitis B crónica (CHB). ) con replicación viral activa. Como controles negativos se utilizaron mitoplastos tratados con nucleasa y núcleos aislados de muestras de tejido hepático obtenidas de ocho pacientes VHB negativos (Pt.1-Pt.8). Se utilizaron mitoplastos a los que se les quitó la membrana externa mitocondrial mediante tratamiento con digitonina para evitar la contaminación citosólica. a Ausencia de genoma completo del VHB y ADNcc del VHB en mitocondrias aisladas de muestras de tejido hepático de pacientes VHB positivos. b Ausencia de genoma completo del VHB y ADNcc del VHB en mitocondrias aisladas de muestras de tejido hepático de pacientes VHB negativos. c Detección del genoma completo del VHB y del ADNcc del VHB en núcleos aislados de muestras de tejido hepático de pacientes VHB positivos. d Ausencia de genoma completo del VHB y ADNcc del VHB en núcleos aislados de muestras de tejido hepático de pacientes VHB negativos. Se utilizaron extractos de ADN total de células HepG2 y el plásmido recombinante pFC80 (que contiene 4 genomas de VHB de 1,0 × de longitud de cabeza a cola) como control negativo y positivo, respectivamente, de los experimentos de PCR. e Detección de secuencias de ARN del VHB correspondientes a las regiones genómicas PreS1, S, X y E épsilon en mitocondrias aisladas de muestras de tejido hepático positivo para VHB, pero no en mitocondrias de tejido hepático negativo para VHB o células HepG2. Se utilizó GAPDH como marcador citosólico y COX3 como marcador mitocondrial. Se detectó ARNm de COX3, pero no ARNm de GAPDH, en las mitocondrias de las mismas muestras de tejido hepático positivo y negativo para VHB o de células HepG2.

a Alineación de secuencias de nucleótidos y estructuras secundarias de ARN mitocondrial dirigidas a señales en ARN de RNasa P y VHB PreS1 (secuencia de referencia de GenBank: NC_003977; nucleótidos del genoma de VHB: 3049–3065). b Inmunotransferencia PNPASE de células HepG2 y HepAD38. Se utilizó β-tubulina como control de carga. c Importación in vitro de fragmentos de ARN del VHB correspondientes a PreS1 (incluida la supuesta señal de direccionamiento de PreS1), polimerasa (Pol) (incluido Stem-loop α, SLα), pgRNA (incluido épsilon) y X (incluido Stem-loop β, SLβ) transcripciones, así como de un fragmento de ARNm de COX3 en mitocondrias de células HepG2. Se incubaron ARN PreS1, Pol-SLα, épsilon y X – SLβ o COX3 (entrada) transcritos in vitro con mitocondrias de células HepG2. El ARN no importado se digirió con nucleasa. d Cuantificación del nivel relativo de importación mediante mediciones densitométricas.

Las mitocondrias aisladas de células HepG2, después del tratamiento con digitonina y nucleasa, se incubaron con ARN del VHB marcados con biotina sintetizados in vitro. Las secuencias de ARN viral biotinilado se eliminaron utilizando perlas recubiertas de estreptavidina y la PNPASE de unión a ARN se detectó mediante análisis de transferencia Western. una PNPASE, pero no HSP90 (usada como control), unida a las secuencias de ARN transcritas in vitro que contienen la supuesta señal de direccionamiento de PreS1 (nucleótidos (nt) 2850–837), Stem-Loop α (nt 670–1350), épsilon ( nt 1781–2068) y Stem-loop β/X (nt 1376–1840). Además, las secuencias de ARN del VHB se unieron específicamente a la PNPASE, aunque la secuencia de ARNm de COX3 no lo hizo. Se utilizó β-tubulina como marcador citosólico y Mortalin como marcador mitocondrial. b Cuantificación de los niveles relativos de PNPASE de unión al ARN del VHB mediante mediciones de densitometría.

En este estudio, desarrollamos un método de secuenciación de integración del VHB (HBIS) de alto rendimiento que permite la identificación sensible de los sitios de integración del VHB y la enumeración de clones de integración. El enfoque HBIS fue adaptado de un método de secuenciación de integración desarrollado originalmente para estudiar el perfil de integración del VIH-1 durante la infección latente y activa21. Este enfoque nos llevó a identificar y caracterizar una gran cantidad de sitios de integración del VHB en tejidos hepáticos tumorales y no tumorales adyacentes de pacientes con CHC relacionado con el VHB. Todos los tejidos tumorales y no tumorales mostraron integración del VHB, con un promedio de 257 integraciones por paciente. De acuerdo con estudios previos7,11,27,41, encontramos que el número total de sitios de integración del VHB y el número de integraciones expandidas clonalmente son mayores en los tejidos tumorales en comparación con los tejidos hepáticos no tumorales. Sin embargo, los tumores mostraron una proporción significativamente mayor de clones pequeños y sitios de integración únicos que los tejidos no tumorales. Estos hallazgos pueden deberse a que los CHC analizados se clasificaron histológicamente como moderadamente diferenciados, apoyaron la replicación y transcripción del VHB y expresaron el receptor de entrada viral NTCP, características que pueden haber hecho que estos CHC sean susceptibles a la acumulación de integraciones con una frecuencia más alta que los CHC adyacentes no. -tejidos tumorales. La persistencia de la replicación del VHB y la aparición de nuevos eventos de integración en los tejidos tumorales también pueden explicar la gran cantidad de genes asociados al CHC a los que se dirige la integración del VHB que se encontraron en cada tumor. Muchas de estas integraciones pueden haber ocurrido en genes cancerosos que ya estaban desregulados; por lo tanto, pueden representar simplemente un epifenómeno y actuar como eventos pasajeros. Sin embargo, algunas de estas integraciones aún podrían tener un papel en la progresión del CHC. Estos resultados sugieren que la diferenciación tumoral y su estado permisivo a la replicación del VHB deben tenerse en cuenta al evaluar la integración del VHB en el CHC. De hecho, tales aspectos pueden influir en gran medida en el número y el tipo de eventos de integración del VHB entre distintos CHC, lo que lleva a resultados sesgados cuando se evalúan y comparan grandes series de tumores con diferentes grados de diferenciación con tejidos hepáticos no tumorales emparejados. Además, de acuerdo con informes anteriores, observamos un enriquecimiento importante de las integraciones del VHB en secuencias repetitivas9,14,16. También confirmamos que los eventos de integración ocurren con mayor frecuencia en repeticiones simples en tejidos no tumorales16 y que en los tejidos tumorales, los sitios de integración viral a menudo se encuentran dentro de elementos transponibles17,18,42, que se sabe que se sobreexpresan y se movilizan en numerosos cánceres humanos43. 44.

Curiosamente, al aplicar el enfoque HBIS y un proceso bioinformático específico, identificamos el ADNmt como un sitio de integración del VHB. De hecho, se encontró un enriquecimiento significativo de la integración viral expandida clonalmente en el ADNmt de muestras de tejido hepático tumoral y no tumoral de cuatro de los siete pacientes estudiados. Considerando que (a) la integración viral en el ADNmt es una mutación adquirida somáticamente de novo, (b) el ADNmt está presente en miles de copias por hepatocito, y (c) las moléculas de ADNmt tanto de tipo salvaje como mutantes pueden coexistir en una sola célula ( heteroplasmia del ADNmt)29, planteamos la hipótesis de que la integración del VHB en estos cuatro pacientes debería haber ocurrido a una tasa bastante constante y alta por replicación del genoma mitocondrial a lo largo de muchas divisiones celulares. Sorprendentemente, los sitios de integración del VHB en el ADNmt de muestras de tejido tumoral se ubicaron tanto en la región del bucle D (el principal sitio de control para la expresión del ADNmt, que contiene el origen de replicación de la cadena principal y los principales promotores de la transcripción45) como en los genes mitocondriales que codifican proteínas del sistema OXPHOS, que sostiene la función mitocondrial y desempeña un papel central en el metabolismo energético celular30, mientras que las integraciones en tejidos no tumorales solo se detectaron en la región reguladora del bucle D. Estos hallazgos nos llevaron a suponer que la integración del VHB en los genes OXPHOS mitocondriales podría ser perjudicial para la supervivencia de los hepatocitos no transformados. De hecho, aunque debe estar presente un número crítico de ADNmt mutantes antes de que las células sufran un daño crítico y se hagan evidentes la disfunción tisular y los signos clínicos (el llamado efecto umbral), los tejidos con un alto requerimiento de metabolismo oxidativo, como el músculo , el cerebro y el hígado tienen umbrales relativamente bajos y son particularmente vulnerables a la mutación del ADNmt46. Por el contrario, las células de cáncer de hígado parecen ser capaces de tolerar la integración del VHB en los genes del sistema OXPHOS. Estos resultados concuerdan con los datos de la literatura que demuestran que las aberraciones que involucran a los genes OXPHOS están notablemente enriquecidas en varios tipos de cáncer47. De hecho, se ha demostrado una gran acumulación de mitocondrias mutadas en los cánceres de riñón, colorrectal y tiroides47, lo que indica una asociación funcional entre la inactivación mitocondrial y los efectos tumorigénicos. Las mutaciones en los genes OXPHOS están asociadas con una regulación positiva de la glucólisis y la producción de lactato, así como con una sobreproducción de ROS y oncometabolitos48, lo que estimula las vías de señalización oncogénica y metabólica e impacta el microambiente del tumor48. Este microambiente modificado puede a su vez inducir la reprogramación metabólica mitocondrial de las células cancerosas49. La plasticidad metabólica de las células neoplásicas conferida por mutaciones del ADNmt es necesaria para satisfacer la biomasa celular y las demandas energéticas necesarias para su proliferación y su adaptación a nuevos microambientes de tumores primarios y nichos metastásicos49,50. Por lo tanto, se podría plantear la hipótesis de que los cambios en los genes OXPHOS inducidos por la integración del VHB podrían persistir y/o seleccionarse para dar forma a la eficiencia metabólica de los hepatocitos preneoplásicos o de las células cancerosas del hígado durante la evolución del tumor.

Con respecto a la región del bucle D mitocondrial, nuestros resultados demuestran que esta región puede verse afectada por la integración del VHB tanto en tejidos hepáticos tumorales como no tumorales, lo que indica que la integración viral en la región del bucle D es un evento que puede preceder a la transformación hepatocelular y podría pasar por una selección positiva durante la hepatocarcinogénesis. La integración del VHB en la región del bucle D puede afectar la replicación y transcripción del ADNmt y puede provocar inestabilidad y mal funcionamiento mitocondrial51. En general, nuestros hallazgos concuerdan con datos de estudios previos que informan una alta frecuencia de mutaciones del bucle D tanto en el CHC como en los tejidos adyacentes sin CHC52,53,54. Por lo tanto, nuestros datos, junto con los hallazgos de estudios previos52,53,54, respaldan la contribución crítica de las mutaciones de la región del bucle D del ADNmt en la hepatocarcinogénesis. Los resultados de nuestro estudio también resaltan un patrón de distribución distinto de los sitios de integración del VHB en el ADNmt en tejidos hepáticos tumorales y no tumorales. Sin embargo, hay que tener en cuenta el hecho de que este estudio solo evaluó una pequeña cantidad de casos y los resultados deben confirmarse en cohortes más grandes de pacientes.

Según el análisis de RNASeq, encontramos que el sitio de inserción del VHB en el ADNmt puede ser transcripcionalmente activo. De hecho, se detectaron transcripciones de fusión VHB-mitocondrial que contienen parte de secuencias mitocondriales de genes OXPHOS tanto en pacientes como en células HepAD38 inducidas por VHB. Utilizamos estas células para una investigación profunda de la integración del VHB en el ADNmt y para evaluar si la integración del VHB puede ocurrir en numts en lugar de en el ADNmt. Está bien documentado que fragmentos de ADN mitocondrial pueden translocarse al genoma nuclear para generar numts31. Sin embargo, desde su descripción en 1983, sólo se han identificado poco más de 1.000 numts en humanos, lo que muestra frecuencias muy bajas en las muestras analizadas. Los números varían en tamaño desde ~50 pb hasta >15 kb, y más del 20% tiene una longitud inferior a 100 pb31,46,55. Teniendo en cuenta que el ADNmt tiene un promedio de varios miles de copias por hepatocito en comparación con las dos copias de numts en el ADN nuclear (ADNn), al aislar las mitocondrias de las células, es posible diluir completamente los numts, lo que lleva a secuencias de ADNmt libres de numts. Por lo tanto, para estudiar la integración del VHB del ADNmt, aislamos núcleos, citoplasma y mitocondrias de células HepAD38 productoras de VHB y aplicamos HBIS y RNASeq. Según HBIS, se identificaron varios sitios de integración del VHB en ADN aislado de mitocondrias, mientras que no se detectó integración en numts de ADNn. Además, RNASeq reveló la presencia de transcripciones mitocondriales quiméricas del VHB dentro de las mitocondrias, pero no en el citoplasma o los núcleos de las células HepAD38 productoras de VHB, y los sitios de inserción del ADNmt pueden ser transcripcionalmente activos en estas células. Tanto el análisis HBIS como el RNAseq también revelaron que MMEJ tiene un papel importante en las integraciones del VHB que ocurren en los genomas mitocondriales. Por lo tanto, en conjunto, nuestros datos demuestran claramente que el VHB puede integrarse en el ADNmt de hepatocitos tumorales y no tumorales. Algunos estudios previos han informado datos sobre la integración del VHB en el ADNmt16,56,57,58,59,60. Todos estos estudios han utilizado métodos de secuenciación de enriquecimiento del genoma del VHB de alto rendimiento para estudiar la integración del VHB, y la mayoría de ellos han analizado líneas celulares de hepatoma que expresan de manera estable el ADN del VHB56,57,58,59. Hasta donde sabemos, sólo uno16 de los Los artículos han informado datos sobre la integración del VHB en el ADNmt de tejidos hepáticos humanos. En particular, en el conjunto de datos complementario de este artículo, se enumeran 58 sitios diferentes de integración del VHB en el ADNmt de muestras de tejido hepático tumoral y/o no tumoral de 11 pacientes con CHC relacionado con el VHB16. Las regiones genómicas mitocondriales a las que se dirigió con mayor frecuencia la integración del VHB en los 11 pacientes fueron la región del bucle D, los genes ND4, ND5, RNR2, CYTB, ND6, ND1, ND2 y COX316. Los eventos de integración del VHB también se han descrito en el ADNmt de muestras de tejido hepático humanizado de ratones quiméricos60. En este estudio, Furuta et al.60 identificaron 50 sitios distintos de integración del VHB en el ADNmt de ratones quiméricos. Estas integraciones (a) se han asociado con niveles más altos de replicación del VHB, (b) ocurrieron con mayor frecuencia en la región del bucle D y (c) parecían depender de MMEJ60. No se ha proporcionado información detallada sobre las uniones virus-ADNmt en estudios realizados en líneas celulares PLC/PRF/556,59. Sin embargo, el hecho de que la integración del VHB en el ADNmt pueda ocurrir en estas células (que no replican el VHB y solo expresan múltiples ARN virales distintos de integrantes del VHB56,59) sugiere que el ARN viral podría estar involucrado en el proceso de integración del VHB en el ADNmt. A pesar de una serie de estudios que documentan la interacción entre las proteínas del VHB y las mitocondrias y la consiguiente alteración de las funciones mitocondriales61,62,63, solo se ha abordado mínimamente si los ácidos nucleicos del VHB pueden translocarse a las mitocondrias. Según nuestros resultados, las transcripciones del VHB, pero no el genoma viral completo o el ADNcc, pueden localizarse en las mitocondrias. Además, la PNPASE, una proteína mitocondrial considerada el primer factor de importación de ARN para las mitocondrias de los mamíferos35,36,39, posiblemente media la entrega de ARN viral a la matriz mitocondrial. Una secuencia de importación de ARN dependiente de PNPASE que identificamos para la transcripción preS1, así como estructuras de bucle de tallo conocidas específicas de las transcripciones del VHB, parecen mediar la orientación mitocondrial de los ARN virales. La localización de las transcripciones del VHB en las mitocondrias nos lleva a plantear la hipótesis de que el ARN viral puede representar un posible sustrato para la integración del VHB en el ADNmt. El genoma mitocondrial es más propenso a sufrir daños y a la formación de roturas de doble cadena (DSB) que el genoma nuclear debido a la exposición frecuente a las ROS generadas por la fosforilación oxidativa mitocondrial y la falta de histonas protectoras. Teniendo en cuenta que varios informes han demostrado que las moléculas de ARN pueden actuar directamente como plantilla para la reparación de DSB mitocondriales en células humanas64, es tentador especular que la explotación viral de esta vía puede conducir a la inserción de secuencias del VHB en el genoma mitocondrial. En resumen, encontramos que el VHB puede integrarse en el ADNmt, y que los tumores y los tejidos hepáticos no tumorales muestran distintos perfiles de integración viral en el genoma mitocondrial. Además, nuestros resultados indican que el ARN del VHB puede importarse activamente a las mitocondrias y que las secuencias de ARN viral podrían estar involucradas en el proceso de integración del VHB en el ADNmt. A pesar de la muestra relativamente limitada de pacientes, este estudio ofrece nuevos conocimientos sobre la interacción VHB-hepatocitos y proporciona una nueva base para análisis de investigación que pueden conducir a una mayor comprensión de los mecanismos por los cuales la inserción del VHB puede impulsar el desarrollo y la progresión del CHC.

Se estudiaron los tejidos tumorales de siete pacientes HBsAg positivos (6 hombres, 1 mujer; edad media 66,7 ± 8 años) con CHC relacionado con el VHB y tejidos no tumorales adyacentes emparejados de seis de ellos. Las características clínicas, histológicas y virológicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1. Se utilizaron como control negativo dos muestras de hígado normales de pacientes VHB negativos que se sometieron a cirugía por metástasis hepática. Todas las muestras de tejido hepático obtenidas mediante resección quirúrgica en la Unidad de Cirugía Oncológica del Hospital Universitario de Messina, Italia, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Además, para estudiar la presencia del genoma libre del VHB y las transcripciones del VHB en las mitocondrias, se congelaron muestras de biopsia de hígado de cinco pacientes con hepatitis B crónica (HBC) HBeAg negativo (2 mujeres, 3 hombres; edad media: 59,4 ± 15,8 años). que muestran replicación viral activa (nivel medio de ADN del VHB en suero: 5,6 × 107 ± 3,06 × 107). Además, en este estudio se incluyeron como grupo de control ocho muestras de biopsia de hígado congeladas de pacientes HBsAg negativos (4 mujeres y 4 hombres; edad media, 53,75 ± 11,5 años) con enfermedad hepática crónica (EPC). Dos de los ocho pacientes tenían una EPC relacionada con el VHC; entre los seis individuos anti-VHC negativos, cinco tenían esteatohepatitis no alcohólica y uno tenía enfermedad hepática criptogénica. Los ocho pacientes dieron negativo para infección oculta por VHB. Todas las muestras de biopsia de hígado antes mencionadas estaban infectadas con el genotipo D del VHB. Ninguno de los pacientes consumía alcohol ni estaba infectado con el virus de la hepatitis delta o VIH. La recolección y procesamiento de todas las muestras fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Messina (protocolo número 64/15) y se llevaron a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki. Todos los individuos dieron su consentimiento informado por escrito.

La extracción de ADN y ARN total de muestras de biopsia de hígado se realizó como se describió anteriormente65. Brevemente, se homogeneizaron muestras de tejido hepático criopreservado de pacientes individuales utilizando un instrumento TissueRuptor (Qiagen, Milán, Italia) en 500 μl de tampón de homogeneización (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) a 4 °C y Luego se dividió en dos partes iguales: una se utilizó para la extracción de ADN y la otra para la extracción de ARN. El ADN hepático total se extrajo de una parte del homogeneizado en NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), EDTA 10 mM, SDS al 1 % y proteinasa K (800 μg/ml) durante la noche a 37 °C. Después de la extracción con fenol-cloroformo, los ácidos nucleicos se precipitaron con etanol puro frío, se resuspendieron y se digirieron con RNasa pancreática (100 μg/ml), seguido de extracción con fenol-cloroformo y reprecipitación en etanol puro frío. El ADN se resuspendió en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) y EDTA 1 mM. El ARN hepático total se extrajo de la otra mitad del homogeneizado de tejido hepático utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) según lo recomendado por el fabricante. Las muestras de ARN se trataron con RQ1 RNase-Free DNase (Promega) durante 30 minutos a 37 °C y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Las concentraciones de ARN y ADN se midieron a 260 nm utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies).

La cuantificación del ADN del VHB intrahepático total y del ADNcc se realizó utilizando el método descrito en la ref. 66, con modificaciones menores. Brevemente, los experimentos de qRT-PCR para evaluar las cantidades de ADN del VHB intrahepático total o ADNcc se realizaron utilizando un Light Cycler v2.0 (Roche Diagnostics) en un volumen de reacción de 20 μl que contenía 100 ng de ADN, 3 mmol/l de MgCl2, 0,5 μmol. /L cebadores directos e inversos específicos (Tabla complementaria 2) y sonda TaqMan marcada con 5'-FAM y 3'-TMR de 0,75 μmol/L (Tabla complementaria 2). Se utilizaron diluciones en serie de un plásmido que contenía un inserto monomérico de VHB (Alfa Wasserman) como estándares de cuantificación. La amplificación del ADN del VHB intrahepático total se realizó en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 s, 57 °C durante 30 s y 72 °C durante 10 s, y 40 °C. durante 2 min. Antes de la qRT-PCR de cccDNA, se trataron alícuotas de extractos de ADN del hígado durante 2 h a 37 °C con 10 U de ADNasa segura para plásmidos (Epicentre, Madison, WI). Luego se realizó la amplificación del ADNcc de la siguiente manera: 95 °C durante 10 min, 50 ciclos de 95 °C durante 10 s, 62 °C durante 30 s y 72 °C durante 20 s, seguido de 40 °C durante 2 min. Para normalizar el número de genomas virales presentes en cada muestra de hígado, se evaluó el número de genomas haploides utilizando un kit de genes de β-globina (Light Cycler-Control Kit DNA; Roche Diagnostics). Para el análisis del ARN del VHB, se transcribieron de forma inversa y se amplificaron 2 μg de ARN tratado con ADNasa utilizando el sistema de síntesis SuperScript First-Strand para RT-PCR (Invitrogen). Se cuantificaron dos microlitros de ADNc mediante qRT-PCR (Light Cycler; Roche Diagnostics) utilizando cebadores y sondas diseñados para cuantificar específicamente el ARN del pregenoma del VHB (ARNpg) (Tabla complementaria 2). Para la cuantificación del ARNm de NTCP, la síntesis de ADNc se realizó utilizando el sistema de síntesis SuperScript First-Strand para RT-PCR (Invitrogen). Las reacciones de PCR cuantitativa se prepararon con SYBR Green (supermezcla SsoFast EvaGreen, Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones se realizaron en un ciclador térmico Light Cycler (Roche Diagnostics) con los cebadores oligonucleotídicos informados en la Tabla complementaria 2. Se usó el conjunto Light Cycler del gen de mantenimiento h-G6PDH (Roche Diagnostics) para normalizar las muestras de ARN. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces.

La línea celular de hepatoma humano PLC/PRF/5 (SIGMA, número de catálogo 85061113, número de lote: 10D004) que contiene múltiples fragmentos de ADN del VHB integrados, la línea celular HepG2 (ATCC, número de catálogo HB-8065TM) y la línea celular Vero (proporcionada por Prof. María Teresa Sciortino) se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con GlutaMAX, 10% FBS, 200 unidades/ml de penicilina y 200 μg/ml de estreptomicina. La línea celular HepAD38 (proporcionada amablemente por el Dr. Cristopher Seeger), que se deriva de células HepG2 y contiene el genoma del VHB (subtipo ayw) bajo un promotor inducible por tetraciclina32, se cultivó en DMEM/F12 con GlutaMAX, 10% FBS, 200 unidades. /ml de penicilina, 200 µg/ml de estreptomicina y 0,3 µg/ml de tetraciclina. En las células HepAD38, la eliminación de tetraciclina induce la producción de ARN del VHB y la secreción de partículas similares al virus en el medio32. Las líneas celulares PLC/PRF/5, HepG2, HepAD38 y Vero dieron negativo mediante tinción Hoechst 33258 para contaminación por micoplasma.

Para la identificación de la integración del ADN del VHB, modificamos un método de secuenciación de integración descrito previamente para estudiar la integración del VIH21. El ADN genómico se obtuvo de todas las muestras de tejido mediante lisis estándar de proteinasa K y extracción con fenol-cloroformo, como se describió anteriormente. Para determinar la cantidad de células hepáticas en cada muestra de tejido, cuantificamos el gen de la beta-globina utilizando un Light Cycler v2.0 y un Light Cycler-Control Kit DNA (ambos de Roche Diagnostics). Para cada muestra, el ADN genómico aislado de 30 millones de células se fragmentó mediante sonicación al 30 % de potencia durante tres ciclos (15 ″ encendido/15 ″ apagado) con un homogeneizador ultrasónico SONOPULS (Bandelin) para producir una distribución de ADN de 100 a 1000 pb. fragmentos. Luego, el ADN se dividió en 6 alícuotas de 5 μg cada una en tubos de microcentrífuga y las reacciones posteriores se realizaron individualmente en estas alícuotas de 5 μg. El ADN se despuntó con el kit de reparación de ADN End-It (Epicentre) y se purificó con MinElute Reaction Clean-up (Qiagen). Se añadió una cola de adenosina al ADN despuntado utilizando 5 µl de tampón NEB 2 (10×), 1 µl de dATP (10 mM) y 2 µl de fragmento Klenow 3- > 5 exo- (5000 U/ml) (New England Biolabs, Ipswich , MA) durante 1 h a 37 °C. Todas las reacciones se purificaron mediante un kit de limpieza de reacciones MinElute (Qiagen). Luego, cada alícuota de fragmentos de ADN de cola A romos se ligó a 200 pmol de enlazadores recocidos (LinkerTop + LinkerBottom) (Tabla complementaria 2) con 4 μL de pLinker, 5 μL de tampón de ADN ligasa NEB T4 y 1 μL de ADN ligasa T4 (2 × 106). U/mL, alta concentración) (New England Biolabs) durante 1 h a 25 °C y luego durante la noche a 16 °C. La ligasa se inactivó mediante incubación a 70 °C durante 20 minutos y las reacciones se purificaron utilizando un kit de limpieza de reacciones MinElute (Qiagen). Finalmente, se combinaron las seis reacciones y el ADN ligado al conector combinado se dividió en dos partes iguales para realizar una PCR mediada por ligadura semianidada con cebadores de VHB directos o inversos (Fig. 1 y Tabla complementaria 2). Las secuencias de enriquecimiento directo e inverso se mantuvieron separadas durante el resto del protocolo. El ADN se dividió en alícuotas de 1 µg; cada alícuota se mezcló con 20 µl de tampón Phusion HF (5 ×), 3 µl de dNTP (10 mM), 1 µl de cebador VHB biotinilado directo (20 µM) o inverso (Tabla complementaria 2) (2,5 µM), 1 µl de Phusion Taq ( 2000 U/ml) (New England Biolabs) y H2O hasta 50 µL. Las PCR con cebador único se realizaron de la siguiente manera: 98 °C durante 1 min; 12 ciclos de 98 °C por 15 s, 65 °C por 30 s y 72 °C por 45 s; 72 °C durante 1 min); y un mantenimiento a 4 °C. Luego, a cada tubo se le añadió 1 μl de pLinker (Tabla complementaria 2) (2,5 μM) y se sometió a ciclos adicionales de PCR, de la siguiente manera: 98 °C durante 1 min; 35 ciclos de 98 °C por 15 s, 65 °C por 30 s y 72 °C por 45 s; 72ºC durante 5 min; y un mantenimiento a 4 °C. Las PCR directas e inversas se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). Los productos purificados se separaron bien en un gel de agarosa al 2% y se extirparon fragmentos de 300 a 1000 pb. El ADN se purificó utilizando un kit de extracción en gel QIAquick y la selección de tamaño y purificación en gel se repitió una vez. Luego, se agregaron 100 μl de perlas de estreptavidina magnéticas T1 (Invitrogen) a cada producto de PCR directa e inversa, y la mezcla se incubó durante 1 h con balanceo suave a temperatura ambiente. Las perlas se aislaron magnéticamente, se lavaron tres veces en 500 µl de tampón 1X B&W (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M) y una vez en H2O y se resuspendieron en 50 µL de H2O. Posteriormente, se mezclaron por separado 25 µl de las perlas de cada una de las PCR directa e inversa con 10 µl de tampón Phusion HF (5x), 1,5 µl de dNTP (10 mM), 1 µl de cebador MiSeq HBV directo (20 µM) o inverso ( 20 μM), 1 μL de MiSeq-pLinker directo o inverso (20 μM) (todos los cebadores MiSeq contienen un adaptador para el recocido de la superficie de la celda de flujo de Illumina) (Tabla complementaria 2), 0,5 μL de Phusion Taq (2000 U/mL) y 11 μL H2O y sometido a PCR (98 °C durante 1 min, 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 40 s y 72 °C–40 s, seguido de 72 °C durante 5 min y un mantenimiento en 4ºC). Los productos de la PCR se separaron magnéticamente de las perlas y se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). Los fragmentos ligados al adaptador se enriquecieron mediante 25 ciclos de PCR con cebadores Illumina Índice 1 e Índice 2, de la siguiente manera: 98 °C durante 1 min, 25 ciclos de 98 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s), y 72 C° durante 5 min. Las bibliotecas directas e inversas para la misma muestra se mezclaron en proporciones equimolares y se secuenciaron mediante secuenciación de extremos emparejados de 250 pb utilizando un Illumina MiSeq. Se construyeron un total de 340 bibliotecas de integración a partir de muestras de tejido hepático de los nueve individuos analizados (7 pacientes con CHC relacionado con el VHB y 2 sujetos HBsAg negativos como control) y de las líneas celulares PLC/PRF/5, HepAD38 y Vero.

Para verificar nuestra estrategia de secuenciación de integración del VHB, construimos 60 bibliotecas utilizando ADN de hígado de dos pacientes no infectados por el VHB y células Vero negativas para el VHB. Además, para analizar la saturación de nuestro enfoque, se construyeron dos bibliotecas de integración separadas utilizando muestras idénticas de los dos pacientes no infectados por el VHB. No se recuperaron secuencias asignadas a sitios de integración viral ni de los pacientes no infectados ni de las células Vero. El enfoque HBIS también se ha verificado analizando la integración del VHB en células de hepatoma PLC/PRF/5, que contienen múltiples fragmentos de ADN del VHB integrados y se han investigado exhaustivamente utilizando diferentes enfoques moleculares, incluidas las estrategias NGS más sensibles56,58. En esta línea celular se detectaron un total de 104 sitios de integración del VHB. Se encontró que doce de los 104 sitios eran puntos de interrupción de la integración del VHB cubiertos por al menos tres lecturas (Tabla complementaria 3 y Datos complementarios 4). Entre estos 12 eventos de integración únicos, se han detectado integraciones virales previamente descritas en la región promotora TERT, en los genes MVK, CCDC57 y UNC5D y aguas abajo del gen STARD1356,58,67. El ADN del VHB que se integra en la región promotora del gen TERT incluía una secuencia [nucleótido (nt) 1260-1391] de la región promotora ENH1/X. En los genes MVK y CCDC57, los integrantes del VHB incluían dos secuencias distintas del gen S (nt 711–817 y nt 491–456, respectivamente). En el gen UNC5D, el integrante del VHB incluía una secuencia del gen Core (nt 2436–2392) (Tabla complementaria 3 y Datos complementarios 4). Además, se identificaron otros sitios de integración del VHB en células PLC/PRF/5, incluido el gen Ninein Like (NINL), el ncRNA LOC105375716, el gen del miembro 8 de la familia del dominio TBC1 (TBC1D8), el pseudogén 4 de la proteína ribosómica S23 (RPS23P4) y ncRNA LOC105374110 y LOC101929814 (Tablas complementarias 3 y Datos complementarios 4). Las integraciones virales en el promotor TERT y el gen CCDC57 se confirmaron mediante PCR y secuenciación de Sanger (Figura complementaria 7).

El ADN genómico aislado como se describe anteriormente se diluyó en serie y se sometió a PCR anidada con cebadores específicos del genoma y cebadores específicos del VHB (Tabla complementaria 2) usando HotStart Taq Polymerase (Qiagen) (98 °C durante 14 min, 40 ciclos de 98 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s, 2 °C 30 s y 72 °C durante 5 min). Los productos fueron aislados mediante electroforesis en gel y secuenciados con el método de Sanger. Para cada amplicón de PCR, utilizamos un analizador de ADN Applied Biosystems 3500 para realizar la secuenciación del terminador de tinte Sanger.

Los ARN totales se extrajeron de tumores congelados o se emparejaron muestras adyacentes no tumorales utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La calidad e integridad total del ARN se evaluaron utilizando el bioanalizador Agilent 2100 (Santa Clara, CA, EE. UU.). La secuenciación se realizó en la plataforma HiSeq 2500 utilizando el kit de ARNm trenzado TruSeq (Illumina).

Para detectar los sitios de integración del VHB en el genoma humano, inicialmente se procesaron lecturas sin procesar de extremos emparejados de Illumina (2 × 250 pb) para eliminar adaptadores y bases de baja calidad con el programa Trimmomatic (v.0.36)68 y las siguientes opciones: ventana de 5 pb, una puntuación de calidad base promedio de 16 y una longitud de lectura mínima de 35 pb. Posteriormente, se utilizó el software BWA (versión: 0.7.12-r1039)69 para alinear las lecturas limpias (lecturas de extremos emparejados y/o no emparejados) con un genoma de referencia personalizado que incluye la referencia humana GRCh38.p10 (acceso a GenBank: GCA_000001405.25). ) y el genotipo D del genoma del VHB (acceso a GenBank: NC_003977.2). Se empleó la herramienta Picard (versión 2.22.0) (http://broadinstitute.github.io/picard) para eliminar lecturas ópticas duplicadas de los archivos BAM; Se utilizó el software SAMtools70 para extraer lecturas quiméricas (bandera SAM 2048; alineación suplementaria 0 × 800). Posteriormente, se utilizó la utilidad BEDTools25 para extraer coordenadas de mapeo primarias y secundarias para contar adecuadamente el número de eventos de integración que ocurren en el genoma híbrido (la bandera -cigarro se usó en la herramienta bamtobed). Las coordenadas genómicas resultantes, incluidas las ubicaciones cromosómicas relacionadas con la integración del ADN del VHB en el genoma humano, se utilizaron para recuperar lecturas relacionadas con cada evento de integración para reconstruir las secuencias quiméricas utilizando el software Cap371 y cd-hit72. Las quimeras ensambladas se mapearon nuevamente en el genoma híbrido utilizando el algoritmo BLAST73 con las siguientes opciones: tarea=blastn-short, polvo=no, soft_masking=false, word_size=7, penalización = -3, recompensa=2, gapopen=5, extensión de brecha = 2. La microhomología se determinó mediante el mapeo del ADN de cada quimera tanto en el genoma humano como en el del VHB.

Se filtraron todos los supuestos sitios de integración identificados y solo se retuvieron aquellas integraciones quiméricas cubiertas por al menos 3 lecturas que se mapean en la secuencia viral flanqueante con al menos 32 pb. En promedio, las quimeras representaron el 0,03% (rango, 0,0045–0,48) del número total de lecturas de buena calidad. Todas las herramientas bioinformáticas descritas anteriormente se han integrado en un proceso computacional automático para la detección precisa y eficiente de eventos de integración viral en el genoma humano que está disponible en el repositorio de GitHub (https://github.com/DomeJoyce/HBVIF).

Además, las integraciones relacionadas con supuestos genes mitocondriales se verificaron dos veces mediante la inclusión en la lista negra de NUMT conocidos informados en la ref. 74 y en ref. 75; luego, alineamos estos NUMT con nuestras integraciones mitocondriales detectadas para confirmar que las integraciones estaban ubicadas correctamente en el mitogenoma, en lugar de en las secuencias mitocondriales nucleares. Finalmente, para tener en cuenta el total de eventos de integración mitocondrial informados hasta el momento, recopilamos de este estudio y otros estudios16,60 todos los eventos de integración del VHB que ocurren en el mitogenoma. Todas las regiones genómicas afectadas por tales eventos se informaron en los Datos complementarios 5 y en la Figura complementaria 8.

Para cada sitio de integración viral detectado, todas las lecturas de soporte se alinearon utilizando el alineador MAFFT76 (opciones utilizadas: –par local, –reordenar, –maxiterar 1000) para inspeccionar manualmente la posición exacta del punto de interrupción a nivel de nucleótidos. Un sitio de integración se consideró clonalmente expandido cuando la mayoría de las lecturas (≥92%) que respaldaban el evento de integración mostraban un punto de interrupción idéntico flanqueado por motivos de secuencia idénticos. Por lo tanto, todos los eventos de integración del VHB identificados se clasificaron en dos categorías: integraciones clonales e integraciones únicas. Para cada cromosoma, se utilizó la prueba de chi-cuadrado para determinar la presencia de diferencias estadísticamente significativas (umbral de valor de P ≤ 0,05) en el número de eventos de integración que ocurren entre las muestras tumorales y no tumorales. Además, se empleó la prueba de chi-cuadrado para evaluar cualquier diferencia estadísticamente significativa en la distribución de los sitios de integración del VHB entre los cromosomas humanos. Se aplicó la prueba de combinación no paramétrica (NCP) para evaluar la probabilidad de que se produzca la integración del VHB en cada cromosoma individual.

La identificación de sitios de puntos de acceso se realizó utilizando la suite BEDTools25. La simulación de Monte Carlo se realizó mezclando aleatoriamente las ubicaciones genómicas de todos los sitios de integración (100, 1000 y 10000 veces) utilizando la utilidad aleatoria BEDTools25. Posteriormente, comparamos el número observado de integraciones con la mediana del número de integraciones en la lista aleatoria. Evaluamos el enriquecimiento contando la frecuencia de eventos observados igual o mayor que el número de eventos aleatorios dividido por n = 100, 1000 o 10,000.

Para determinar si un motivo de secuencia particular de origen humano o viral estaba sobrerrepresentado en las secuencias quiméricas, utilizamos el software HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer) y los conjuntos de datos correspondientes al virus humano-humano. –secuencias quiméricas de virus y virus humano. Específicamente, cada conjunto de datos quiméricos se analizó por separado y, para el análisis estadístico, se utilizaron como secuencias de fondo los datos específicos del genoma apropiado (humano, VHB y genoma híbrido humano-virus).

Solo se dispuso de material suficiente para realizar el fraccionamiento subcelular y el aislamiento mitocondrial a partir de muestras de tejido tumoral obtenidas de los pacientes 0501, 0504 y 0505. Además de los tejidos tumorales de estos pacientes, el fraccionamiento subcelular y el aislamiento mitocondrial se realizaron en muestras de tejido hepático de cinco CHB. pacientes con altos niveles de replicación del VHB, un paciente VHB negativo y células HepG2 y HepAD38 siguiendo el método descrito previamente en la ref. 77. Brevemente, se utilizaron 150 mg de tejido hepático congelado de cada paciente y 8 × 107 células HepG2 o HepAD38 para el aislamiento de mitocondrias. Las muestras de tejido hepático se homogeneizaron en tampón MitoPrep frío (manitol 0,225 M, sacarosa 0,075 M, HEPES 20 mM, pH 7,4) con EDTA 1 mM y PMSF 0,5 mM utilizando un homogeneizador TissueRuptor (Qiagen). Las células HepG2 y HepAD38 se recogieron mediante centrifugación a 2000 xg durante 2 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS 1 x pH 7,4 (Lonza), se resuspendieron en tampón MitoPrep (manitol 0,225 M, sacarosa 0,075 M, HEPES 20 mM, pH 7,4) con EDTA 1 mM y PMSF 0,5 mM y se homogeneizaron con una aguja de 23 G. Los homogeneizados fueron sometidos al mismo protocolo para el aislamiento nuclear y mitocondrial. Específicamente, los homogeneizados de células y tejidos se centrifugaron a 800 xg durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y se colocaron en hielo, y los sedimentos se volvieron a homogeneizar con una aguja de 27 G, se resuspendieron en tampón MitoPrep y se centrifugaron a 800 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los sedimentos que contenían núcleos se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis. Los dos sobrenadantes de cada muestra se combinaron y se centrifugaron a 800 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes resultantes se transfirieron a tubos nuevos y se centrifugaron a 11.000 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes obtenidos que contenían las fracciones citoplasmáticas se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis; Los sedimentos mitocondriales se resuspendieron en 200 µL de tampón MitoPrep y se incubaron con 300 U de nucleasa microcócica S7 (Thermo Scientific), CaCl2 10 mM y 1 µL de digitonina 10 mg/mL (Sigma-Aldrich) durante 25 minutos a 27 °C. La reacción se detuvo con EDTA 5 mM. Los mitoplastos se sedimentaron a 11.000 xg durante 4 minutos a 4 °C y se utilizaron para extracción de ADN, extracción de ARN, ensayos de importación de ARN in vitro o ensayos de extracción de ARN.

Las regiones genómicas preS1 y X del genotipo D del VHB (ayw) se amplificaron mediante PCR, y los fragmentos resultantes de 1169 pb y 468 pb (posiciones de nucleótidos 2850–837 y 1372–1840 en el mapa del VHB, respectivamente) se clonaron en el Vector TOPO direccional pcDNA3.1 (Life Technologies), generando pcDNA-preS1 y pcDNA-X. Las regiones genómicas del VHB correspondientes a la secuencia “épsilon” de la señal de encapsidación del ARN pregenómico (pgRNA) y al tallo-loop α (SLα) del elemento regulador postranscripcional (PRE) también se amplificaron mediante PCR, y los 287- Se clonaron fragmentos de pb y 680 pb (posiciones de nucleótidos 1781–2068 y 670–1350, respectivamente) para construir pcDNA-Epsilon y pcDNA-SLα. Además, la secuencia de ARN de COX3 mitocondrial humana (posición nt 9397–9796) se amplificó por PCR a partir de células HepG2 y el fragmento de 399 pb obtenido se insertó en el vector TOPO bidireccional para generar pcDNA-COX3.

Las transcripciones se sintetizaron utilizando ARN polimerasa T7 (Roche Diagnostics) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ARN marcado con biotina, se utilizó un kit de deshtiobiotinilación Pierce 3' END (Thermo Fisher Scientific). El ARN se purificó utilizando el reactivo TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los ensayos de importación de ARN in vitro se realizaron en un volumen de 200 µl que contenía 50 µg de mitoplastos, manitol 0,225 M, sacarosa 0,05 M, HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 25 mM, MgCl2 5 mM, ATP 5 mM, succinato 15 mM y 2 mM TDT. Después de la incubación a 30 °C durante 5 minutos, se agregaron 200 ng de ARN al tampón de importación y las reacciones se incubaron a 30 °C durante 10 minutos. A continuación, se agregaron 300 U de nucleasa microcócica S7 y CaCl2 10 mM, y las muestras se incubaron durante 30 minutos a 27 °C. La mezcla se transfirió a un tubo nuevo y los mitoplastos se sedimentaron a 11.000 xg durante 5 minutos a 4 °C, se disolvieron en tampón de carga de urea-SDS (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8, SDS al 2 %, EDTA 5 mM, 25% de glicerol, 0,01% de azul de bromofenol, 10 μg/ml de proteinasa K y urea saturada) y se calentó a 50 °C durante 5 min. El ARN y las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE. Luego, las muestras se analizaron utilizando un kit de detección e hibridación quimioluminiscente North2South (Thermo Fisher Scientific).

El ARN transcrito de pcDNA-preS1, pcDNA-SLα, pcDNA-X, pcDNA-Epsilon y pcDNA-COX3 se marcó en el extremo 3' utilizando un kit de deshtiobiotinilación Pierce 3' END (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron gránulos de mitoplastos de 8 x 107 células HepG2 para ensayos de extracción de ARN. Los sedimentos se resuspendieron en 200 µl de tampón MitoPrep y se incubaron con 300 U de nucleasa microcócica S7 (Thermo Fisher Scientific) y CaCl2 10 mM a 27 °C durante 20 minutos. Luego se sedimentaron los protoplastos a 11.000 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los sedimentos se disolvieron en 30 µl de tampón MitoPrep y se sonicaron en hielo durante 2 s. La extracción de ARN se realizó utilizando un kit Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-down (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, para cada ensayo, se incubaron 50 pmol de ARN biotinilado o ARN de control con 50 µl de perlas de estreptavidina-agarosa prelavadas a 4 °C durante 1 h. Las perlas unidas a ARN se incubaron con lisados ​​de mitoplastos y las proteínas eluidas se detectaron mediante transferencia Western.

Las células se lavaron dos veces en PBS 1x, pH 7,4, y se lisaron en tampón de lisis celular Triton X-100 1x (Cell Signaling Technology) suplementado con PMSF 1 mM. Las mitocondrias se lisaron directamente en 1x tampón de carga SDS. Los lisados ​​de proteínas (50 μg), así como las proteínas eluidas in vitro, se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF Immobilon-P (Millipore) y se incubaron durante 1 h con leche desnatada con bloqueador de grado de transferencia al 5 %. (Bio-Rad) TBS-T y luego durante la noche con anticuerpos primarios en BSA al 5% a 4 ° C o durante 1 a 2 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos utilizados incluyeron anti-PNPasa de conejo (GTX118737, 1:500, GeneTex), anti-Mortalin de conejo (3593, 1:500, Cell Signaling Technology), anti-β Tubulina de ratón (86298, 1:1000, Cell Signaling Technology) , ratón anti-Hsp90 (ab13492, 1:500, Abcam). La detección se realizó utilizando IgG anti-conejo o anti-ratón (AP307P, AP308P, 1:3000, 1:1000, Millipore), respectivamente. Las señales inmunorreactivas se detectaron utilizando el sustrato quimioluminiscente Pierce SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y las variables categóricas como frecuencia absoluta y porcentaje. Se aplicó un enfoque no paramétrico para examinar la distribución de las variables, como lo verifica la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se aplicaron las pruebas de χ2 o exacta de Fisher para comparar grupos de variables categóricas. Se aplicó la prueba t de Student para la comparación entre grupos de variables numéricas. Se aplicó la prueba NPC con la función de combinación de Fisher para combinar los valores de P de diferentes comparaciones. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 22.0 para el paquete Windows. Se consideró estadísticamente significativo un valor de AP inferior a 0,05. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales. Se realizaron experimentos de cuantificación por PCR en tiempo real, ensayo de importación de ARN, análisis desplegable de ARN y experimentos de transferencia Western al menos dos veces con resultados similares.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación informados en este artículo se han depositado en la base de datos NCBI SRA (acceso a DNA-seq [PRJNA650273]; estudio SRA: SRP283983). Los autores declaran que todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria o están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable. En las figuras complementarias se proporcionan escaneos sin recortar. 9–13.

El software o algoritmos clave utilizados en nuestro análisis de datos de secuenciación se enumeran en Métodos. Todas las herramientas bioinformáticas descritas en Métodos se han integrado en un proceso computacional automático que está disponible en el repositorio de GitHub (https://github.com/DomeJoyce/HBVIF).

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Descargar referencias

Este estudio fue financiado en parte por una subvención otorgada por el Ministerio de Educación, Universidad e Investigación de Italia (MIUR), PRIN 2017 (2017MPCWPY_003) a G. Raimondo.

Giuseppina Raffa

Dirección actual: Laboratorio de Hepatología Molecular, Hospital Universitario de Messina, Messina, Italia

Estos autores contribuyeron igualmente: Domenico Giosa, Daniele Lombardo.

Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Hospital Universitario de Messina, Messina, Italia

Domenico Giosa, Daniele Lombardo, Valeria Chines, Giuseppina Raffa, Francesca Casuscelli di Tocco, Deborah D'Aliberti, Carlo Saitta, Giovanni Raimondo y Teresa Pollicino

Laboratorio de Hepatología Molecular, Hospital Universitario de Messina, Messina, Italia

Domenico Giosa, Daniele Lombardo, Cristina Musolino, Valeria Chines, Francesca Casuscelli di Tocco, Deborah D'Aliberti, Giuseppe Caminiti y Teresa Pollicino

Departamento de Patología Humana, Hospital Universitario de Messina, Messina, Italia

Cristina Musolino y Giuseppe Navarra

Departamento de Economía, Universidad de Messina, Messina, Italia

Angela Alibrandi

Sequencia Biotech Sl, Barcelona, ​​España

Riccardo Aiese Cigliano

Departamento de ChiBioFarAm, Universidad de Messina, Messina, Italia

Horacio Romeo

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TP y G. Raimondo concibieron el estudio. TP, DG, DL, DD, CM, G. Raffa, GC, RAC y OR contribuyeron a las canalizaciones y/o a la gestión de datos. DG, RAC y OR analizaron los datos de secuenciación. DG, OR y TP analizaron e interpretaron los datos. DG y AA realizaron análisis bioinformáticos y estadísticos. CS y G. Raimondo analizaron los datos clínicos. CM, VC, G. Raffa, FCT y DD realizaron la secuenciación. DL, CM, G. Raffa y VC realizaron experimentos de laboratorio. GN proporcionó muestras de tumores. TP escribió el manuscrito con la ayuda de todos los autores. TP supervisó el proyecto.

Correspondencia a Teresa Pollicino.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Valeria Naim y Christina Karlsson Rosenthal. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Giosa, D., Lombardo, D., Musolino, C. et al. El ADN mitocondrial es un objetivo de la integración del VHB. Común Biol 6, 684 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05017-4

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Recibido: 29 de junio de 2022

Aceptado: 05 de junio de 2023

Publicado: 03 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05017-4

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