Detección visual y ultrasensible del genotipo de norovirus humano GII.4 o GII.17 mediante CRISPR

Revista de Virología volumen 19, Número de artículo: 150 (2022) Citar este artículo

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La integración de sensores CRISPR-Cas12a con amplificación de señal isotérmica se puede aprovechar para desarrollar ensayos ultrasensibles, desechables y de bajo costo para el diagnóstico de patógenos humanos.

Se exploraron ensayos de tira de flujo lateral (LFS) y fluorescentes de punto final o en tiempo real mediados por RT-RAA-Cas12a para la detección directa del genotipo GII.4 o GII.17 de norovirus (NOV).

Los resultados mostraron que nuestro ensayo LFS y fluorescente mediado por RT-RAA-Cas12a podía detectar NOV GII.4 o GII.17 al apuntar al gen de la proteína viral 1. Nuestro ensayo LFS y fluorescente mediado por RT-RAA-Cas12a puede detectar específicamente NOV GII.4 o GII.17 sin reactividad cruzada para otros virus relacionados. El límite bajo de detección podría alcanzar 0,1 copias/μL en aproximadamente 30 a 40 minutos, y los resultados se visualizaron utilizando un iluminador de luz ultravioleta o en un LFS sin equipo complejo. Además, nuestro ensayo LFS y fluorescente mediado por RT-RAA-Cas12a proporcionó una alternativa visual y más rápida al ensayo de RT-PCR en tiempo real, con un acuerdo predictivo positivo del 95,7 % y el 94,3 % y un acuerdo predictivo negativo del 100 %.

En conjunto, nuestro enfoque mediado por RT-RAA-Cas12a tendría un gran potencial para el diagnóstico en el lugar de atención de NOV GII.4 y/o GII.17 en entornos con recursos limitados.

Los norovirus humanos (NOV) ahora se reconocen como la principal causa de la mayoría de las gastroenteritis no bacterianas [1]. Los NOV son un grupo de virus de ARN que pueden causar síntomas como vómitos agudos y diarrea que generalmente duran 48 h tanto en niños como en adultos por lo demás sanos. Los NOV son altamente infecciosos, ya que incluso unas pocas partículas pueden causar enfermedades y las personas infectadas liberan grandes cantidades de virus [2, 3]. Los NOV se transmiten principalmente a los humanos a través de la exposición a alimentos y agua contaminados como resultado del contacto directo o indirecto con heces humanas infectadas por NOV [4], o dentro de aerosoles generados por los vómitos de personas infectadas [5]. Como resultado de la alta infectividad de los NOV y su capacidad de transmisión eficiente, se han informado brotes de NOV en todo el mundo en entornos comunitarios cerrados, incluidos hospitales y residencias de ancianos, y por lo tanto requieren medidas de intervención para reducir la infección agresiva [6].

Los norovirus humanos poseen una inmensa diversidad genética con diez genogrupos diferentes (GI-GX) y al menos 48 genotipos identificados [7]. Se sabe que los genogrupos GI, GII y GIV de NOV están asociados con la infección humana. Entre aproximadamente 21 genotipos de NOV GII, el genotipo GII.4 ha sido responsable de la mayoría de los casos clínicos de infección irruptiva de NOV en la última década [8]. Recientemente, ha surgido un nuevo genotipo de NOV GII.17 que se ha extendido rápidamente hasta convertirse en la cepa dominante de NOV en algunas partes de Asia, lo que plantea el riesgo de nuevas amenazas de brotes [9]. Hasta ahora, aparte de unos pocos informes sobre tratamientos antivirales eficaces en humanos [10], actualmente no existe ninguna vacuna NOV autorizada para humanos disponible [11]. Como resultado, una detección más rápida y temprana de la infección por NOV desempeña un papel importante a la hora de facilitar la intervención temprana, el tratamiento y la prevención de la infección, lo que, a su vez, puede mitigar el riesgo de transmisión del virus infeccioso.

El estándar de oro actual para detectar NOV son las técnicas moleculares que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), la RT-PCR anidada y la RT-PCR en tiempo real [12]. Entre esos métodos, la RT-PCR en tiempo real se ha empleado ampliamente para detectar o diagnosticar la infección por NoV debido a su alta sensibilidad y especificidad, así como a su bajo riesgo de contaminación por arrastre. Actualmente, varios ensayos de RT-PCR en tiempo real disponibles comercialmente demostraron la sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real a 10-50 copias del genoma/reacción para NoV GI y 1-300 copias del genoma/reacción para NoV GII [13]. Sin embargo, el método de RT-PCR en tiempo real generalmente depende de equipos sofisticados y personal altamente calificado, y tiene un tiempo de reacción promedio de ~ 2 h, lo cual no es adecuado para un método simple, rápido y en el punto de atención (POC). ) ensayo molecular para diagnosticar la infección por NOV en áreas con recursos limitados para la detección de rutina. En un estudio reciente, Sun et al. presentó un método colorimétrico en papel para detectar y distinguir los genotipos GII.4 y GII.17 de NOV [14]. Sin embargo, la prueba que utiliza este método necesita un tiempo relativamente largo (~ 3 h) y el rango de detección está limitado entre 2,6 fM y 0,5 pM y, por lo tanto, es menos sensible en comparación con la RT-PCR [14]. Por el contrario, debido a su excelente rapidez, sensibilidad y especificidad, el sistema de detección de ácidos nucleicos basado en nucleasas agrupadas guiadas por ARN, que consta de repeticiones palindrómicas cortas regularmente espaciadas (CRISPR) y sus nucleasas asociadas a CRISPR (Cas), ha demostrado recientemente un potencial considerable para explotar el diagnóstico molecular POC de próxima generación para patógenos infecciosos [15,16,17]. Actualmente, la eficacia de varias versiones de nucleasas Cas, incluidas Cas12a, Cas12b, Cas13a y Cas14, se ha evaluado en ensayos tanto in vitro como in vivo [18,19,20,21]. Entre estas nucleasas, Cas12a (anteriormente Cpf1) es una endonucleasa de clase II tipo V. Cas12a que contiene un dominio de nucleasa RuvC es introducido por un único ARN CRISPR (ARNcr) que contiene una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM) rica en T para escindir el ADN bicatenario (ADNds) en un sitio específico, o sin PAM para realizar una escisión de ADNss no específica. en trans in vitro [18]. Además, la combinación de nucleasas Cas12a con amplificación de polimerasa recombinasa (RPA) o transcripción inversa-RPA (RT-RPA) se ha explorado a fondo para desarrollar el sistema CRISPR Trans Reporter dirigido a ADN endonucleasa (DETECTR) y mejora significativamente la sensibilidad y especificidad de la detección de ácidos nucleicos. 18].

En este estudio, al apuntar al gen de la proteína viral 1 (VP1) del genotipo GII.4 y GII.17 de HNOV, se utilizó una combinación de amplificación asistida por recombinasa de transcripción inversa (RT-RAA) con CRISPR-Cas12a, denominada RT-RAA. -Cas12a, es capaz de detectar pocas copias de ácidos nucleicos (ARN) con un grado de especificidad mucho mayor sin necesidad de instrumentos de alto coste. Además, nuestro método de tira fluorescente y de flujo lateral (LFS) mediado por RT-RAA-Cas12a se validó aún más al analizar 80 muestras clínicas y logró resultados altamente consistentes con los del método RT-PCR convencional. En resumen, demostramos un ensayo mediado por CRISPR-Cas12a para la detección POC rápida, ultrasensible, específica y visual, sin instrumentos, del genotipo GII.4 o GII.17 de NOV.

Se recogieron un total de 80 muestras de heces archivadas con valores de Ct inferiores a 30 (< 30 Ct) de personas que presentaban síntomas clínicos relacionados con NOV, entre las cuales 40 y 30 muestras dieron positivo para el genotipo NOV GII.4 y GII.17, respectivamente. y 10 muestras, incluido GII. 2, GII. 3 y GII. 6 según un método anterior [22]. Estas muestras utilizadas en este estudio fueron recolectadas por el Centro Municipal para el Control y la Prevención de Enfermedades (NCDC) de Ningbo entre enero de 2016 y diciembre de 2020. La aprobación ética para este estudio se obtuvo del comité de ética del NCDC.

GENEWIZ Inc. (Suzhou, China) generó el extintor FAM-TTATTATT (ssDNA FQ), FAM-TTATTATT-biotina (ssDNA FB) y las sondas. Los oligonucleótidos de todos los cebadores empleados en este estudio fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China) y se muestran en la Tabla 1. El kit de amplificación de ácido nucleico RT-RAA se adquirió de Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co., Ltd (Wuxi, China). NEbuffer 2.1 y Cas12a se adquirieron de New England Biolabs (MA, EE. UU.). El LFS se compró a Tiosbio (Nanjing, China).

Se recuperaron secuencias completas del genoma de diferentes cepas de NOV genotipo GII.4 o GII.17 de la base de datos NCBI y se alinearon utilizando ClustalW. Según el resultado de la alineación, se determinó como objetivo una región de consenso específica del gen de la proteína viral 1 (VP1) correspondiente a las secuencias 4991–5380 (Fig. 1). El fragmento de ADN de la secuencia diana se sintetizó y se insertó en el plásmido pBluscript II SK (+) (Sangon, Shanghai, China) (Fig. 1). El pBluscript-NOV resultante se transformó en células TOP10 de Escherichia coli para construir la cepa recombinante TOP-NOV. Luego, se extrajo el pBluscript-NOV utilizando el kit TIANprep Mini Plasmid (Tiangen Biotech, Beijing, China) y se linealizó con Sac I. El pBluscript-NOV lineal se empleó como plantilla de la reacción de transcripción in vitro (IVT) para generar Estándar de ARN NOV utilizando el kit IVT T7 (TaKaRa, Dalian, China). La mezcla de reacción IVT estaba compuesta por 5 μL de tampón de transcripción 10 ×, 5 μL de cada solución de NTP, 1 μL de inhibidor de RNasa, 5 μL de ARN polimerasa T7, 6,5 μL de agua libre de RNasa y 12,5 μL de pBluscript-NOV lineal. plásmido, y se incubaron a 39 ° C durante 2 h. Finalmente, la concentración de ARN en nanogramos se convirtió a la del número de copias de ARN usando la siguiente fórmula: número de copias de ARN = [M (ng/μL) × 6,02 × 1023]/(N × 109 × 340), donde M se refiere al ARN concentración cuantificada por un espectrofotómetro (Metash Instruments, Shanghai, China), N se refiere a la longitud del ARN.

Visualización de cebadores para la amplificación asistida por recombinasa con transcripción inversa (RT-RAA) y sitios espaciadores de ARNcr en la secuencia del gen de la proteína viral diana 1 (VP1) del genoma NOV. Los cebadores RT-RAA están indicados por rectángulos rojos. Los crRNA están programados para atacar específicamente el gen VP1 de los norovirus (NOV) GII.4 y GII.17

Se determinaron cuatro ARNcr con diferentes nucleótidos de secuencias espaciadoras de ARNcr dirigidas a la región altamente conservada del gen VP1 y se evaluaron adicionalmente para determinar la especificidad de cada ARNcr para el genotipo GII.4 o GII.17 de NOV utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica. Además, los 21 nucleótidos de 5′-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3' se utilizaron para la secuencia madre del crRNA y sirvieron como armazón de unión para Cas12a. La preparación de crRNA se realizó mediante el siguiente paso. GENEWIZ sintetizó químicamente los oligonucleótidos para la producción de la preparación de ARNcr enumerados en la Tabla 1. (Suzhou, China) y recocido. Los ADN de doble hebra resultantes (ADNbc) se transcribieron adicionalmente mediante transcripción in vitro utilizando el kit IVT T7. La reacción de transcripción comprendió 5 µL de tampón de transcripción 10 ×, 5 µL de cada solución de NTP, 1 µL de inhibidor de RNasa, 5 µL de ARN polimerasa T7, 9 µL de agua libre de RNasa y 10 µL de ADNds recocido, y se incubó a 39 °C durante 2 h. Los productos de ARNcr resultantes se purificaron mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol, y la concentración de ARNcr se determinó utilizando un espectrofotómetro.

El rendimiento de RT-RAA se evaluó comparando tres factores que constan de diferentes cebadores, la especificidad y la sensibilidad del ensayo. La mezcla de reacción RT-RAA comprendía 25 µL de tampón de reacción V, 2 µL de cada cebador (10 µM), 16,5 µL de ddH2O, 2 µL de ARN estándar y 2,5 µL de acetato de magnesio 280 mM. Luego, los tubos de reacción se colocaron en el instrumento isotérmico Axxin T8 precalentado durante 20 minutos a 39 °C. Posteriormente, los productos RT-RAA se trataron con un volumen igual de 50 μL de fenol/cloroformo, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa (2%) y finalmente se evaluaron bajo luz ultravioleta (UV).

El ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a se llevó a cabo utilizando 5 μL de productos RT-RAA en un volumen de reacción total de 50 μL, así como 45 μL de la mezcla de reacción CRISPR-Cas12a, que contenía 5 μL de 10 × NEBuffer. 2.1, 1 l de ARNcr de 100 nM, 1 l de Cas12a 1 mM, 0,5 l de inhibidor de RNasa (40 U) y 2 l de informadores de ADNss de 1 mM, 35,5 l de agua libre de RNasa. Luego, las reacciones se llevaron a cabo en el instrumento isotérmico Axxin T8 precalentado durante 15 minutos a 39 °C con señales fluorescentes recolectadas cada 10 s (sustratos ssDNA FQ = λex: 485 nm; λem: 535 nm) y se visualizaron mediante un iluminador de luz UV. y LFS con ssDNA FB como sustratos.

La especificidad del ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a se realizó analizando cada muestra de ARN a una concentración de 200 copias/μL de otros virus gastrointestinales, incluidos el rotavirus humano (HRV), el astrovirus (HAtV) y el enterovirus 71 (HEV71). En este estudio se emplearon como control 10 muestras diferentes que dieron positivo para cada virus de prueba, así como 10 muestras no GII.4 o GII.17.

Para evaluar la sensibilidad del ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a, se utilizó como plantilla un gradiente de concentración de muestras estándar de ARN, que se ajustó a 200, 100, 10, 1, 0,5, 0,1 y 0,05 copias/μl. Reacción RT-RAA. Todos los volúmenes del ensayo mediado por Cas12a fueron 50 µl como se describió anteriormente. Cada proceso de reacción se replicó tres veces y los resultados se analizaron mediante fluorescencia y LFS.

El ARN total de 80 muestras, cada una de 200 µL de solución clínica, se extrajo manualmente utilizando el kit de ADN/ARN viral BeaverBeads™ BEAVER, Suzhou, China) y se realizó automáticamente utilizando un instrumento automático de extracción de ácido nucleico (tecnologías bioPerfectus, Jiangsu, China). respectivamente. La detección por RT-PCR de ácidos nucleicos NOV de muestras clínicas se realizó utilizando el kit de prueba NOV (bioPerfectus technologies, Jiangsu, China) en un ABI 7500 (Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron con un paso inicial de transcripción inversa a 48 °C durante 30 min, seguido de 95 °C durante 15 s, 35 ciclos de 95 °C durante 15 s y 53 °C durante 1 min.

Cada muestra se realizó en al menos tres réplicas biológicas independientes. El análisis estadístico de los datos relacionados con la fluorescencia de punto final se realizó utilizando Prism 8 (software GraphPad, versión 8.0.1) y las diferencias estadísticas se evaluaron mediante la prueba t de Student. Se aplicó la prueba t de dos colas no pareada para investigar las diferencias entre grupos y el umbral para definir la significancia se basó en el valor de p <0,05.

Primero optimizamos los cebadores RT-RAA para el ensayo RT-RAA porque el par de cebadores óptimo jugó un papel crucial en las altas productividades del ADNbc en condiciones optimizadas. La región altamente conservada del gen VP1 del genoma de NOV se determinó como los sitios objetivo del ARNcr basándose en la alineación de los genomas de NOV GII.4 y GII.17 informados, que mostraron una homología de secuencia del 92,95 %. En este estudio, basándose en la secuencia del gen VP1, se diseñaron diferentes pares de cebadores y ARNcr para seleccionar pares de cebadores y ARNcr óptimos (Fig. 1). La eficiencia de amplificación de cuatro pares de cebadores se investigó y comparó con concentraciones estándar de ARN de 1 × 105 copias/μl a 39 °C durante 20 minutos utilizando el kit RT-RAA. Como se demuestra en la Fig. 2a, solo los pares de cebadores NOV-F2/NOV-R1 generaron bandas claras con un tamaño esperado de 369 pb a 1 × 105 copias/μL. Posteriormente, se validó la especificidad de NOV-F2/NOV-R1 utilizando otras muestras de ARN viral como plantilla con una concentración de 1 × 105 copias/μl. La Figura 2b indicó que los pares de cebadores NOV-F2/NOV-R1 no reaccionaron de forma cruzada con otros virus relevantes, incluidos HRV, HAtV y HEV71. Además, se aplicaron diluciones en serie del estándar de ARN que oscilaron entre 1 × 102 y 1 × 105 copias/μL para evaluar la sensibilidad de la reacción RT-RAA. La Figura 2c mostró que NOV-F2/NOV-R1 produjo una banda única y clara en concentraciones de 1 × 104 copias/μL. A partir de estos datos, llegamos a la conclusión de que NOV-F2 y NOV-R1 era el par de cebadores más eficaz y, por tanto, se empleó para los experimentos posteriores.

Evaluación de pares de cebadores para la amplificación asistida por recombinasa con transcripción inversa (RT-RAA). a Los pares de cebadores óptimos para RT-RAA se evaluaron con el estándar de ARN de NOV GII.4 o GII.17 a 1 × 105 copias/μL, respectivamente. Carril 1: NOV-F1/NOV-R1; Carril 2: NOV-F2/NOV-R1; Carril 3: NOV-F1/NOV-R2; Carril 4: NOV-F2/NOV-R2. b La especificidad del ensayo RT-RAA se realizó con tres virus gastrointestinales, incluidos el rotavirus humano (HRV), el astrovirus (HAtV) y el enterovirus 71 (HEV71), y los resultados se demostraron mediante electroforesis en agarosa. NC, control negativo. c La sensibilidad del ensayo RT-RAA se realizó utilizando la concentración del estándar de ARN de NOV GII.4 y GII.17 que oscila entre 1 × 105 y 1 × 102 copias/μl.

Para evaluar la viabilidad del ensayo de fluorescencia de punto final o en tiempo real mediado por RT-RAA-Cas12a para la detección de NOV GII.4 o GII.17, se identificaron cuatro reactivos básicos del ensayo: ARNcr, Cas12a, ADN objetivo, y reporteros de ssDNA FQ. Se prepararon e investigaron cuatro sistemas de reacción con diversos reactivos. Después de 20 minutos de incubación a 39 ° C, solo el sistema de reacción que incluía productos RT-RAA, crRNA, Cas12a y ssDNA FQ generaron una señal de fluorescencia brillante (Fig. 3a), donde la intensidad de la fluorescencia mejoró continuamente con el aumento del número de escisión. de los reporteros de ssDNA FQ. En particular, se observó un cambio de color de azul a verde en el tubo de reacción n.° 1 cuando se iluminó con un iluminador de luz ultravioleta (Fig. 3b).

Análisis de viabilidad del ensayo basado en RT-RAA-Cas12a para la detección de NOV GII.4 o GII.17. La fluorescencia en tiempo real (a) y de punto final (b) del ensayo basado en RT-RAA-Cas12a se examinó en presencia o ausencia de reactivos básicos a 39 °C durante 30 minutos. Las imágenes de los tubos se tomaron bajo luz ultravioleta (UV) después de 30 minutos de incubación.

El crRNA apropiado facilitó el emparejamiento de bases de la semilla de crRNA con la cadena objetivo de dsDNA, lo que produjo alta fidelidad y sensibilidad. En este estudio, se diseñaron y prepararon cuatro ARNcr utilizando los oligonucleótidos mediante transcripción in vitro. Se evaluó la eficiencia de escisión inducida por el complejo Cas12a-crRNA-diana. La Figura 4a, b mostró que la eficiencia de la escisión trans de Cas12a mediada por crRNA1, crRNA2-2 y crRNA3 tuvo una diferencia estadística significativa en las intensidades de fluorescencia en comparación con el grupo negativo, lo que indica que crRNA1 sin secuencia PAM también puede activar la actividad de escisión de Cas12a con especificidad prominente, y así eliminar el requisito de limitación de secuencia PAM. Sin embargo, estudios previos indicaron que la secuencia PAM es un factor clave en la escisión colateral inespecífica de Cas12a para apuntar al ADNds y, por lo tanto, el crRNA1 sin secuencia PAM puede aumentar la incertidumbre del sistema de detección [23]. Curiosamente, el grupo mediado por crRNA2-2 exhibió la respuesta de fluorescencia más rápida en comparación con otros grupos inducidos por crRNA, y la señal de fluorescencia se saturó a los 3 minutos. Además, se observó la conversión mediada por ARNcr de una señal fluorescente verde a una señal fluorescente azul en el grupo tratado con ARNcr1, ARNcr2-2 o ARN3 bajo un iluminador de luz UV, en comparación con el grupo tratado con ARNcr2-1 y sin ARNcr. (Fig. 4c), y el grupo mediado por crRNA2-2 produjo una intensa fluorescencia azul bajo irradiación UV en comparación con otros grupos tratados con crRNA. Por lo tanto, se utilizó crRNA2-2 en los experimentos posteriores de RT-RAA-Cas12a.

Detección de ARNcr óptimo para el ensayo basado en RT-RAA-Cas12a. Las lecturas de fluorescencia en tiempo real (a) y de punto final (b) basadas en RT-RAA-Cas12a se midieron después de la incubación con 30 nM de diferentes ARNcr durante 15 min y 14 min a 39 °C, respectivamente. Se realizaron tres réplicas para cada muestra. Las barras de error se refieren a las desviaciones estándar en tres réplicas (n = 3). Se aplicó un análisis estadístico para evaluar la diferencia entre los grupos de prueba con respecto a NC. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. NC, control negativo. c Visualización de la detección basada en RT-RAA-Cas12a bajo luz ultravioleta (UV)

Para lograr un mejor rendimiento del ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a, se investigó el efecto de la concentración de ARNcr en el ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a fijando la proporción de ARNcr2-2 a Cas12a (1:1). Como se demuestra en la Fig. 5a, hubo una muy buena relación lineal en la intensidad de la señal en una concentración de crRNA2-2 entre 5 y 20 nM, lo que confirma que la velocidad de reacción de Cas12a aumentó con la concentración de crRNA2-2. Por el contrario, las intensidades de fluorescencia se mantuvieron estables con aumentos adicionales en la concentración de crRNA2-2 entre 20 y 30 nM. Un estudio anterior ha demostrado que el exceso de mezcla de Cas12a y crRNA2-2 puede conducir a una escisión independiente del crRNA [24], lo que indica que el exceso de crRNA puede provocar potencialmente un mayor riesgo de falsos positivos. Por lo tanto, se aplicaron concentraciones de 20 nM de crRNA2-2 para nuestro ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a para el siguiente sistema de detección. De manera similar, en el ensayo LFS mediado por RT-RAA-Cas12a, para evaluar la influencia potencial de la cantidad de crRNA2-2 en las respuestas falsas positivas solo en ausencia de los productos de amplificación objetivo, se utilizan varias concentraciones de crRNA2-2 de 5 Se aplicaron a 30 nM y la reacción se visualizó en LFS. Como se esperaba, el ensayo tuvo un tiempo de ejecución rápido de 30 a 40 minutos y no se obtuvieron respuestas falsas positivas con varias concentraciones de crRNA2-2 entre 5 y 30 nM (Fig. 5b), lo que sugiere que 20 nM de concentración de crRNA2-2 puede ser útil en la siguiente detección de LFS mediada por RT-RAA-Cas12a para garantizar el límite de detección alto.

El efecto de varias concentraciones de crRNA2-2 sobre el rendimiento del ensayo basado en RT-RAA-Cas12a. a Las lecturas de fluorescencia basadas en RT-RAA-Cas12a se midieron después de la incubación con 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 nM de crRNA2-2 durante 15 min y 10 min a 39 °C, respectivamente. Hubo un aumento obvio en la fluorescencia en la concentración de crRNA2-2 entre 5 y 20 nM, mientras que las intensidades de fluorescencia se mantuvieron casi constantes con el aumento adicional de crRNA2-2 de 20 a 30 nM. b Para probar si las altas concentraciones de crRNA2-2 podrían causar resultados falsos positivos, se examinaron diferentes concentraciones de crRNA2-2 utilizando lecturas de tira de flujo lateral (LFS) solo en ausencia de los productos de amplificación en el ensayo basado en RT-RAA-Cas12a. No se encontraron resultados falsos positivos en altas concentraciones de crRNA2-2, como 20 nM y 30 nM.

La especificidad se determinó utilizando otras muestras genómicas virales. Para examinar la señal generada por Cas12a cuando se usa fluorescencia o flujo lateral, el rendimiento de la lectura mediada por RT-RAA-Cas12a en productos idénticos mediante la visualización de señales de fluorescencia en tiempo real y en el punto final, y por flujo lateral en 0, 3 , 6 y 10 min. Como se demuestra en la Fig. 6a, los datos de fluorescencia en tiempo real mediados por RT-RAA-Cas12a mostraron un rendimiento superior con alta especificidad sin reacciones cruzadas con objetivos que no son GII.4 o GII.17, y fueron detectables en <1 min. De manera similar, los datos mostraron claramente una detección eficiente y específica de NOV GII.4 o GII.17 al comparar la fluorescencia del punto final después de 14 minutos de tiempo de reacción (Fig. 6b). Específicamente, la señal de fluorescencia verde del punto final se observó bajo luz ultravioleta mientras que la señal de fluorescencia azul se observó en otras muestras, lo que indica que los resultados de la visualización se observaron a simple vista utilizando un equipo simple (Fig. 6c), simplificando la operación. del tratamiento de la muestra. Mientras tanto, nuestro ensayo de tira de flujo lateral mediado por RT-RAA-Cas12a mostró una alta especificidad para la detección de NOV GII.4 o GII.17 y produjo una lectura cualitativa fácil de interpretar para la presencia o ausencia del virus objetivo (Fig. 6d).

Especificidad y sensibilidad del ensayo de tira de flujo lateral (LFS) y fluorescencia basado en RT-RAA-Cas12a. a – d La especificidad de la fluorescencia en tiempo real y de punto final mediada por RT-RAA-Cas12a y el ensayo LFS se realizaron con rotavirus humanos (HRV), astrovirus (HAtV) y enterovirus 71 (HEV71) en concentraciones de 200 copias/μL. . Visualización del ensayo Cas12a en NOV VP1 en tiempo real (a), punto final (b), bajo luz ultravioleta (UV) (c) y por LFS (d). (e – h) La sensibilidad se realizó con un gradiente de concentración de ARN estándar de NOV que oscilaba entre 200 y 0,05 copias/μl. Visualización del ensayo de Cas12a en NOV VP1 en tiempo real (e), punto final (f), bajo luz ultravioleta (UV) (g) y por LFS (h), respectivamente. Se realizaron tres réplicas para cada muestra. Las barras de error indican las desviaciones estándar de tres réplicas (n = 3). Se empleó análisis estadístico para evaluar la diferencia entre los grupos de detección y NC. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. NC, el control negativo. Ctrl es la línea de control. La prueba se refiere a la línea de prueba.

A continuación, se registraron una serie de ARN estándar de NOV diluidos para probar la capacidad analítica de la fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y LFS. "Como se muestra en la Fig. 6e, el rendimiento de fluorescencia positiva se observó con una mejora gradual a medida que la concentración del ARN objetivo aumentaba de 0,05 a 200 copias/μL. La Figura 6e-g presentó claramente que la fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a podía detectar consistentemente hasta ~ 0,1 copias/μL de objetivos de ARN NOV GII.4 o GII.17 tanto en tiempo real como en detección de fluorescencia de punto final. Además, la señal positiva se visualizó fácilmente a simple vista y mediante LFS, lo que sugiere que el ensayo LFS mediado por RT-RAA-Cas12a exhibió un alto nivel de sensibilidad para el ARN de NOV GII.4 o GII.17. Especialmente, el LFS mediado por RT-RAA-Cas12a contribuye mucho en la aplicación práctica, especialmente para la detección rápida en el sitio. Por lo tanto, al apuntar al gen VP1 de NOV GII.4 o GII.17, nuestro ensayo de fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y LFS mostró un método rápido, ultrasensible y específico para la detección de NOV GII.4 o GII.17 en el ácido nucleico. nivel.

La extracción manual de ARN para 80 muestras clínicas identificadas utilizando perlas magnéticas procesadas tarda aproximadamente 2 h, lo que prácticamente se puede realizar utilizando un equipo separador magnético simple en entornos de escasos recursos y elimina la necesidad de equipos costosos. Se probaron un total de 80 extractos de ARN en ensayo LFS y fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a. Para garantizar la precisión de la detección, cada muestra de ARN se midió en experimentos triples independientes. Como se demuestra en la Tabla 2, los resultados de nuestras lecturas de fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y LFS fueron muy consistentes con los del método RT-PCR para la detección de NOV en 80 muestras de heces en total. La concordancia predictiva positiva de la fluorescencia mediada por Cas12a y el ensayo LFS para muestras RT-RAA en el ensayo RT-PCR fue del 95,7 % y 94,3 %, respectivamente, mientras que la concordancia predictiva negativa fue del 100 %. La alta concordancia entre nuestros resultados de la fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y las lecturas de LFS podría atribuirse al hecho de que Cas12a puede unirse específicamente al gen objetivo a través de la guía de crRNA y activarse en presencia de genes objetivo VP1 amplificados por RT. -RAA, lo que resulta en el corte de las moléculas informadoras ssDNA FQ o ssDNA FB mediadas por Cas12a. Además, como se muestra en la Fig. 7, las muestras clínicas se analizaron mediante el ensayo LFS mediado por RT-RAA-Cas12a, incluidos los genotipos NOV GII0.2, GII0.3 o GII0.6, pero solo se detectaron GII.4 y GII.17. por LFS.

Los resultados de muestras clínicas representativas, incluidos los genotipos GII.2, GII.3, GII.4, GII.6 y GII.17 de norovirus (NOV), utilizando el ensayo de tira de flujo lateral basado en RT-RAA-Cas12a para NOV GII.4 o GII.17 detección

En humanos, se ha informado que los virus norovirus GII.4 son responsables de la mayoría de las infecciones gastroentéricas durante más de dos décadas [3]. Recientemente, se ha informado de la aparición del nuevo genotipo de norovirus GII.17, que reemplazó a la cepa pandémica GII.4 como la principal causa de brotes de gastroenteritis en China y Japón desde la temporada de invierno de 2014 y 2015 [9]. El diagnóstico temprano es crucial para detener la propagación generalizada de este virus. Actualmente, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) representa el método más utilizado de forma rutinaria para la detección temprana de patógenos; sin embargo, la RT-PCR, que destaca una necesidad crítica de equipos de laboratorio especializados y profesionales capacitados, no es aplicable a las pruebas de diagnóstico rápido POC. Las limitaciones de los enfoques de detección actuales constituyen barreras graves para el seguimiento en tiempo real y la detección más temprana del patógeno altamente infeccioso en entornos de bajos recursos, con el objetivo de reducir la transmisión comunitaria y hospitalaria. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un método de diagnóstico basado en ácidos nucleicos rápido, simple, económico y eficiente que sea factible para el uso rutinario de POC en entornos de bajos recursos.

En este estudio, presentamos un ensayo de fluorescencia y LFS mediado por RT-RAA-Cas12a simple, rápido y altamente específico para la detección de NOV GII.4 y/o GII.17. Nuestro ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a combina completamente una amplificación isotérmica de muestras de ARN con ARNcr optimizados con alta sensibilidad y especificidad para permitir una detección sólida de NOV GII.4 y/o GII.17. En particular, los resultados de detección del ensayo de fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y LFS se pueden evaluar mediante múltiples métodos, incluido el ojo desnudo bajo UV, LFS y fluorescencia en tiempo real y de punto final. La aplicación de lecturas basadas en fluorescencia en tiempo real ofrece ensayos sensibles y altamente específicos que están libres de contaminación. Además, la interpretación de resultados basada en la detección a simple vista y LFS es independiente de equipos sofisticados y técnicos profesionales, lo que proporciona una herramienta ventajosa para POC y entornos con pocos recursos. Además, en las lecturas de fluorescencia de punto final, las intensidades de fluorescencia se recogieron durante la reacción de amplificación y es posible permitir la detección semicuantitativa determinando los datos de fluorescencia de punto final.

El ensayo LFS mediado por RT-RAA-Cas12a se llevó a cabo utilizando el ssDNA FB Reporter cuyos ambos extremos estaban marcados con FAM y biotina [23, 25]. Para la muestra negativa, el anticuerpo anti-FAM de partículas de oro primero se conjugó suficientemente con el indicador FB de ADNss y luego se capturó con estreptavidina ubicada en la banda de control. Por el contrario, para la muestra positiva, cuando se escindió el indicador ssDNA FB, el FAM libre resultante se conjugó con un anticuerpo anti-FAM de partículas de oro, y el complejo se acumuló en la banda de prueba y la acumulación del complejo disminuyó. correspondientemente en la banda de control. Por lo tanto, la fuerza de la banda de prueba dependía de la eficiencia de escisión y era inversamente proporcional a la de la banda de control.

En comparación con nuestro método de detección previamente informado del ácido nucleico NOV GII.4 basado en RT-RAA-Cas12a [23], este nuevo ensayo fue altamente específico y ultrasensible para la detección de NOV GII.4 o GII.17. Curiosamente, en comparación con nuestra publicación anterior [23], en este estudio, la introducción del ensayo de fluorescencia de punto final mediado por RT-RAA-Cas12a puede ser preferible para una lectura simple mediante un lector fluorescente portátil que funciona con baterías. o la luz ultravioleta de mano en entornos de bajos recursos. Además, el ensayo puede generar resultados de amplificación en tiempo real en <15 minutos, lo que elimina la necesidad de abrir los viales de reacción después de la reacción, simplificando así el flujo de trabajo y minimizando el riesgo de contaminación. Esta sensibilidad ultraalta podría atribuirse a la alta amplificación de RT-RAA utilizando cebadores RT-RAA óptimos, así como a la actividad endonucleasa eficiente del objetivo impulsada por Cas12a a través de la relación de concentración optimizada de crRNA a Cas12a. Además, dado el estricto reconocimiento de Cas12a basado en secuencias, este nuevo ensayo mostró una alta especificidad en la detección de NOV GII.4 y/o GII.17 sin reacción cruzada con otras secuencias virales, lo que destaca su potencial como una potente herramienta para diagnóstico de enfermedades.

Para evaluar la validez y el potencial clínico del ensayo de fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y LFS, se utilizaron ARN virales extraídos de NOV en muestras fecales, logrando resultados de detección altamente consistentes con los del método RT-PCR, con 95,7% y 94,3. % de acuerdo predictivo positivo y 100% de acuerdo predictivo negativo. Las muestras falsamente negativas de la fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a y del ensayo LFS se seleccionaron para su verificación. Los resultados mostraron que los resultados falsos negativos se pueden atribuir a reactivos o consumibles, incluido el reactivo liofilizado y LPS para el ensayo RT-RAA. Por lo tanto, es necesario mejorar aún más la fiabilidad de los reactivos o consumibles. Significativamente, nuestro ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a puede continuar reduciendo y agilizando los pasos operativos con una cámara portátil basada en microfluidos. Específicamente, mediante la integración de cebadores específicos secados al aire, sondas de fluorescencia, RT-RAA y Cas12a y reactivos líquidos para la extracción de ácidos nucleicos empaquetados en paquetes adhesivos, se puede aprovechar una plataforma de diagnóstico molecular rápida y sencilla de muestra a resultado para su uso en entornos de bajos recursos como aeropuertos, departamentos de emergencia locales y clínicas [26]. Además, al combinar la tecnología de detección multiplexada de microfluidos [27], nuestro ensayo mediado por RT-RAA-Cas12a se puede realizar para permitir la detección multiplexada de la muestra al mismo tiempo, detectando y diferenciando NOV y otras infecciones patógenas.

En resumen, al combinar la detección de ácido nucleico asistida por CRISPR-Cas12a, la amplificación isotérmica mediada por RT-RAA y la tira de flujo lateral, se estableció un ensayo práctico de fluorescencia mediado por RT-RAA-Cas12a o LFS para la detección de NOV GII. 4 y/o GII.17. Dada su velocidad, simplicidad y bajo costo, el ensayo de fluorescencia mediada por RT-RAA-Cas12a o LFS es muy prometedor para la detección temprana de NoV GII.4 y/o GII.17, especialmente en entornos de bajos recursos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

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No aplica.

Este estudio recibió financiación de la Fundación de Ciencias Naturales de China (Nº 81973531), el Proyecto de Investigación Fundamental de la Comisión de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen (Nº 20200812211704001), la Fundación de Investigación Científica Médica de la Provincia de Guangdong (Nº A2019502), la Fundación Programa de investigación financiado por el Departamento de Educación Provincial de Shaanxi (Nº 22JC010) y el Programa de Ciencia y Tecnología de la Administración Estatal de Supervisión y Administración del Mercado (Nº 2021MK107).

Escuela de Ingeniería Biológica y Alimentaria, Universidad de Ciencia y Tecnología de Shaanxi, Xi'an, 710021, República Popular China

Weidong Qian, Jie Huang y Ting Wang

Instituto de pruebas de supervisión de la calidad del producto de Shaanxi, Xi'an, 710048, República Popular de China

Cheng Fan y Jie Kang

Departamento de Dermatología, Hospital de Shenzhen de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Shenzhen, 518052, República Popular de China

Qian Zhang

Centro Municipal de Ningbo para el Control y la Prevención de Enfermedades, Ningbo, 315010, República Popular de China

Yong Dong Li

Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Shenzhen, Shenzhen, 518060, República Popular China

Si Chen

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WQ, YL, SC, QZ: conceptualización, redacción-revisión y edición. JH, TW y YL: software, investigación, validación, adquisición de datos. YL, CF y QZ: análisis e interpretación. TW y JK: metodología, supervisión. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yongdong Li o Si Chen.

La recolección de muestras clínicas fue aprobada por el Centro para la Prevención y el Control de Enfermedades de Ningbo.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Qian, W., Huang, J., Wang, T. et al. Detección visual y ultrasensible del genotipo de norovirus humano GII.4 o GII.17 mediante el ensayo CRISPR-Cas12a. Virol J 19, 150 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01878-z

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Recibido: 04 de junio de 2022

Aceptado: 01 de septiembre de 2022

Publicado: 17 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01878-z

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